2023/04/03 17:44
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产品配置单:
力显智能科技INVIEW激光共聚焦超分辨STORM原理显微镜iSTORM
型号: iSTORM
产地: 浙江
品牌: 力显智能科技
¥350万 - 400万
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超高分辨显微镜iSTORM
型号: iSTORM 3CM
产地: 浙江
品牌: 力显智能科技
¥350万 - 500万
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赛乐微培养箱中实时监测细胞生长的智能监控助手
型号: 细胞智能监控助手赛乐微
产地: 浙江
品牌: 力显智能科技
¥4.97万 - 4.98万
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方案详情:
同时,研究者利用PALM/STORM成像实现了癌源性外泌体和溶酶体在受体细胞中的共定位。由于外泌体在细胞间通讯中起着至关重要的作用,研究者预计所提出的基于PALM/STORM的外泌体成像和跟踪在研究外泌体介导的癌症转移机制中具有巨大的潜力。
#01
研究介绍
#02
结果和讨论(节选)
2.1.外泌体的分离和TEM分析
图1 从HeLa细胞(a)和SKBR3细胞(b)分离的外来体的透射电子显微镜(TEM)图像
2.2基于PALM/STORM的癌症来源的外来体的超分辨率成像
2.2.1.HeLa外泌体中CD63的超分辨率成像
单个HeLa衍生的外来体的成像结果示于图2中。在膜染料CM-Dil的帮助下,研究者可以鉴定外泌体的存在。图2b示出了通过用561 nm激光激发CM-Dil的外来体的TIRF图像。在定位外泌体后,进行这些外泌体的PALM/STORM成像,结果示于图2c中。图2c的左下图是从15000帧重建的CD 63的PALM/STORM图像。而图2c的右上图是如图2b所示的相同区域的宽场TIRF图像。显然,与TIRF图像相比,PALM/STORM图像提供了高得多的空间分辨率。从免疫荧光样品中获得了特异性的进一步证据。通过用PBS替换兔抗CD 63抗体并保持其他程序和反应条件不变来制备对照样品。对照样品的结果示于图2d和2 e中。CM-Dil通道证实了外来体的定位,然而,观察到Alexa Fluor 647的荧光可忽略不计(图2 e)。这充分证明了在没有一抗的情况下,Alexa Fluor 647标记的二抗不能与外来体膜蛋白反应。结果,在图2c中观察到的Alexa Fluor 647的荧光真正来源于CD 63,并且IF反应显示出良好的特异性。
根据图2g和2 h中所示的PALM/STORM成像的外来体的横截面图,外泌体的最终重建超分辨率图像达到70 nm的半峰全宽(FWHM),这与外泌体的直径(30-100 nm)很好地对应。相反,CD 63的TIRF图像远大于单个外来体的大小(图2f和2 h)。这证明与常规宽场TIRF相比,PALM可以提供更可靠的外泌体结构信息。
图2 HeLa外来体的TIRF和PALM/STORM成像
图3两个相邻外来体的成像(a)常规TIRF图像;(B)PALM/STORM图像
荧光显微镜的一个明显优势是通过用光谱上不同的荧光团标记两种或更多种成分同时成像的优异性能。在癌症疾病的研究中,同时监测不同的受体/生物标志物可以提供关于患者的生理状态的更可靠的信息。例如,乳腺癌的诊断需要同时分析各种受体/生物标志物,例如人表皮生长因子受体-2(HER 2)、表皮生长因子受体(EGFR)、雌激素受体(ER)和孕酮受体(PR)。由于外泌体在肿瘤转移中起重要作用,因此外泌体上不同受体的同时成像可以为研究外泌体介导的癌症转移提供信息。因此,证明了外泌体上两种受体的同时双色PALM/STORM成像。为了实现双色PALM/STORM成像19,除Alexa Fluor 647外,还使用了Alexa Fluor 488。先前的研究表明,Alexa Fluor 488也适用于PALM/STORM成像。此外,它的荧光信号可以很好地与Alexa Fluor 647区分开来,这可以大大防止双色成像中的串扰。来源于SKBR 3细胞的外泌体在此用作模型外泌体,并且待成像的靶受体是CD 63和HER 2(人表皮生长因子受体-2)。由C-erbB-2/HER 2阳性肿瘤细胞系SKBR 3释放的外来体表现出HER 2/C-erbB-2过表达。此处,如材料和方法部分中所述,CD 63用Alexa Fluor 647 IF标记,HER 2用Alexa Fluor 488 IF标记。为了构成有效标记的额外证据,我们使用共聚焦显微镜的波长扫描功能来描绘Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647和CM-Dil标记的外来体的荧光发射强度。与理论分析一致,两种染料的荧光信号可以很好地区分,这防止了多色成像中的串扰。外泌体膜用CM-Dil染色。此处还添加空白对照以证明IF的特异性。
双色PALM/STORM成像结果见图4。红色通道是CD 63,绿色通道是HER 2,黄色通道是外来体膜。可以看出,Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 647的荧光信号都可以在SKBR 3外来体上检测到(图4a、d和b、e)。虽然在空白对照中没有检测到对应于这些荧光团的荧光(图4g和h),但证实IF标记具有优异的特异性并且双色标记是成功的。与图4d和4 e中所示的PALM/STORM图像相比,图4a和4 b中所示的宽场TIRF图像表现出不令人满意的分辨率。图4f中所示的合并的双色PALM/STORM图像表明CD 63和HER 2都在SKBR 3外来体上表达。上述实验结果表明,使用PALM/SORM和IF技术可以实现外泌体上不同蛋白质的同时双色超分辨率成像。
图4 SKBR 3衍生的外来体中CD 63和HER 2的双色超分辨率成像
图5 SKBR 3外泌体的细胞内追踪
图6 SKBR 3外来体和MRC-5溶酶体的共定位
上述实验结果证实,即使在被其他细胞摄取后,标记的外泌体的PALM/STORM成像仍然可以实现,并且内化的外泌体的分布可以通过所提出的基于PALM的方法直接可视化,这表明PALM/STORM技术在研究外泌体及其内容物(即miRNA、DNA、蛋白质等)的细胞内动力学中的潜在应用。
#03
结论
使用IF和PALM/STORM技术实现癌症来源的外来体的基于单分子定位的超分辨率成像。与传统的视场显微镜相比,PALM/STORM为观察外来体提供了更好的空间分辨率,其尺度可达纳米级。此外,还呈现了癌症来源的外泌体的同时双色PALM成像。通过与传统的宽视野显微镜相比,很明显,使用PALM/STORM成像技术,研究者可以更精确地可视化掺入的外泌体的细胞内位置。因此,PALM/STORM是一种新的强大的方法,用于细胞内跟踪外来体和其他纳米结构,具有优异的空间分辨率。此外,凭借这些优异的特性,我们有充分的理由相信,超分辨率成像将非常适用于后续的外泌体和外泌体相关生理过程的研究。
力显智能现已发布的超高分辨率显微成像系统 iSTORM,成功实现了光学显微镜对衍射极限的突破,使得在20纳米的分辨率尺度上从事生物大分子的单分子定位与计数、亚细胞及大分子复合物结构解析、生物大分子生物动力学等的研究成为现实,从而给生命科学、医学等领域带来重大突破。
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