利用小角X射线散射得到脂质纳米颗粒的相图

通过高通量SAXS揭示脂质纳米颗粒的温度-pH相变。

1、介绍

       脂质纳米颗粒（LNPs）由于其生物相容性，可以封装疏水药物和遗传物质而受到了广泛关注，所以被认为是一种有潜力的药物载体。了解LNPs的热行为和相变对于优化其稳定性和药物负载能力至关重要。

       小角X射线散射（SAXS）是一种无损技术，可以对溶液中LNPs进行结构表征。由于SAXS可以研究多个数量级的长度尺度，因此它可以同时提供有关LNPs整体尺寸和内部脂质结构的信息。另外，由于SAXS可以进行高通量分析，它可以研究大量的配方和条件的结构。由于这两个特点，SAXS是一种非常适合用于测量脂质纳米颗粒相图的技术。

2、测试

      脂质纳米颗粒是通过将有机溶液和水溶液进行微流体混合制备的。有机溶液由DSPC/胆固醇/MC3/DMG-PEG在乙醇中按照摩尔比10/40/48/2混合而成。水溶液由醋酸钠缓冲液（50mM NaOAc pH 5.0）组成。为了制备装有RNA的脂质纳米颗粒，加入Poly(A) RNA至水溶液中。随后将脂质纳米颗粒透析到PBS中并进行离心浓缩。然后，通过将脂质纳米颗粒与不同pH值的醋酸盐缓冲液混合到最终浓度为100mM NaOAc来改变pH值。测得的混合物pH值则作为脂质纳米颗粒的pH值。

      在配备了GeniX 3D Cu微聚焦光源的Xeuss 3.0上进行测试，使用自动样品装载的BioCUBE样品环境。在每个pH值点，将样品都放入BioCUBE中，然后温度从10℃增加到60℃，每隔10℃进行一次SAXS测试。

3、结果

      图1显示了全部温度下LNPs随pH值变化的SAXS数据。该数据以2D图的形式展示，其中散射矢量q位于x轴，pH值位于y轴，SAXS强度的对数作为色轴。不同温度下的数据叠加在一起。随着pH值的增加，散射的特性发生了变化，在pH值约为6时出现明显的变化。随着温度的升高，pH值随之变小。有趣的是，在高温（顶部）和中等pH值条件下，散射数据中出现了一个新的特征，在q约为0.08 Å-1的位置。

图1 LNPs的SAXS数据随着不同温度下pH值的变化。色轴为散射强度的对数。图中pH值作为y轴，温度范围从10°C（底部）到60°C（顶部）。

        在无需对散射图掌握很多知识的情况下绘制一个相图，基于Hura等人[1]开发的比率的波动性（VR）度量进行了SAXS相似性分析。我们使用这个方法开发了一个结构相关图（SCM），并根据相似性对散射曲线进行了分组。分组后的结构相关图如图2a所示。蓝色代表相似的结构，红色代表不相似的结构。然后确定了不同的分组，并为它们分配了一种颜色（在图2a中用大方块表示）。接着，通过将颜色与每个温度和pH值的测量相对应，构建了一个相图。最后，为了展现出不同分组之间的差异，在图2c中给每个分组绘制了一个散射曲线。

图2 利用结构相关图来识别不同相位。a) 这是根据温度-pH SAXS数据进行分组的结构相关图。矩阵中的每个点显示了一对SAXS数据的相似性分析，以渐变色显示，颜色从高相似性的深蓝色到低相似性的深红色。用方块突出显示了已确定的不同区域，每个方块的颜色对应于相位的颜色。b) 这是脂质纳米颗粒的温度-pH相位图。c) 从每个确定的分组中选择了每个相位的散射曲线。每条散射曲线的颜色对应于所确定的每个分组的颜色。为了更容易观察，我们对散射曲线进行了偏移。

       为了验证上述开发的方法，现在将注意力转移到从散射数据中获得的模型自由参数。在较小的散射角度下，得到了旋转半径和零角散射的数值，分别如图3a和3b所示。在较大的散射角度下，对RNA的散射峰进行拟合，以获取相应的d-间距、半峰宽（FWHM）和峰高。根据统计阈值，可以用一个或两个洛伦兹峰来拟合数据。图3c显示了用于拟合数据的峰数。图3d-f显示了第一个峰的拟合数值，而图3g-i显示了第二个峰的拟合数值（中心位置，分别为d-间距、半峰宽、峰高）。

图3 从SAXS数据中提取的参数随着温度和pH值的变化而变化。显示了旋转半径（a）、零角散射强度（b）、拟合的峰数（c）、以及峰1h（d-f）和峰2（g-i）的特性（d-间距，半峰宽，峰高）。

        虽然每个提取的参数LNPs的不同性质的变化有不同的敏感度，但它们都与图2b中显示的SCM推导的相属性一致，表现出相变行为。通过计算得到的数值，可以帮助我们更好地理解与相变相关的脂质纳米颗粒结构的变化。

4、结论

        使用高通量小角X射线散射技术来研究不同温度和pH条件下脂质纳米颗粒的结构。我们采用了两种方法：一种是通过对结构相关图的聚内分析得到实际相图；另一种是基于散射物理的方法，计算无模型散射特性。这两种方法的结果都显示，在pH范围为5.5-6.0的情况下存在相变，随着温度升高，相变向更低的pH值方向移动。

       虽然在这项工作中，并没有直接推断这些相的性质和物理意义，但这是可以做到的，特别是通过辅助技术（比如冷冻电镜）来做到这一点。类似的方法已被用于将不同脂质纳米颗粒配方的散射特性与它们的结构和体内活性联系起来[2]。通过这种方式，利用高通量SAXS推导的相图可以帮助设计配方，然后可以通过其他方法进一步分析少量数据点，从而更全面地了解这个系统。