一站式Western印迹套装--洗膜液

一站式Western印迹套装--洗膜液

产品及特点 Western Blot 是检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫方法，又叫免疫印迹 （immunoblotting）。该方法的是先将蛋白质从凝胶中转移到固相基质（硝酸纤 维素膜）上；再对其进行特异性抗体检测。由于涉及多种溶液，用户单独配制的 话十分繁琐，为此开发了本产品。它具有下列特点:

1. 一站式，提供除水、样品和抗体以外的所有成分（检测方法有 HRP 或 AP 检测法两种）。

2. 即开即用，用户不需单独准备各种成分，十分方便。

3. 灵敏，可检测 10 pg 的蛋白质（HRP 或 AP 检测法）。

4. 灵活，与 SDS-PAGE、非变性 PAGE 胶、等电聚焦电泳等兼容。

产品及特点 Western Blot 是检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫方法，又叫免疫印迹 （immunoblotting）。该方法的是先将蛋白质从凝胶中转移到固相基质（硝酸纤 维素膜）上；再对其进行特异性抗体检测。由于涉及多种溶液，用户单独配制的 话十分繁琐，为此开发了本产品。它具有下列特点:

规格及成分

运输及保存 常温运输和保存，显色试剂需 4℃保存，有效期一年。

自备试剂 去离子水、滤纸、特异一抗、HRP 或 AP 标记的二抗。

使用方法

一：转膜（湿法电转移）

1. 制备湿法电转液:将湿法电转液干粉全部溶解在 1 L 去离子水中得 20×湿 法电转液，用时用去离子水稀释 20 倍预冷待用。

2. 根据 PAGE 胶的大小剪切同样大小的滤纸和各边都大 1 mm 的硝酸纤维 素膜（以下简称膜）。避免手直接接触膜。

3. 将切好的膜浸泡在新鲜稀释的 1×湿法电转液（下简称转移液）中 15-20 分钟。注意：最好用镊子夹住膜的一边轻轻置于转移液上，只让膜下层与 转移液接触，通过毛细管作用使整个膜浸湿。避免让膜沉入转移液中，否 则膜与转移液之间形成的气泡会阻止膜的湿润。

4. 在容器中将两块海绵垫、六层滤纸用转移液浸湿。

5. 在转移夹上依次放上一张浸湿的海绵垫、三层浸湿的滤纸、一块 PAGE 胶 （只要分离胶部分）、一张浸湿的膜、三层浸湿的滤纸、一张浸湿的海绵 垫。注意：每叠加层一定要用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。膜两边 的滤纸绝对不能相互接触，否则电转移时会发生短路，烧坏装置。

6. 合起转移夹并放入转移槽中（一定要注意方向，转印带负电荷的蛋白质时 电极方向是膜正胶负；转印带正电荷的蛋白质时，电极方向是膜负胶正）， 然后用预冷的转移液灌满转移槽。

7. 插上电极，一般在冷却条件下用 100V 恒压转移 30-60 分钟或冷室中 14V 转移过夜。 注意：一定要检查电流的大小，电流一般在 0.1-0.4A。应根据蛋白分子量 的大小确定转膜时间，对于小分子量的蛋白，转膜时最好垫 2 张或更多张 膜（最多可 10 张），即使白质已经转过了第一张膜，还会在其它膜上检测 到；对于大分子量的蛋白，转膜时电压要高一点，时间也要延长一点，开 始最好也用两块或多张膜。转移时间长的时候特别要注意加强降温措施。 如果目的蛋白转移效率低，可以在转移液中加终浓度为 20%的甲醇或 0.1%的 SDS。

8. 终止转移后，取出膜，并在膜上剪去一个小角以标记方向。如有必要可用 自备的各种染液对胶或膜进行染色以确定蛋白质转移效率。

二：封膜

1. 将膜转移至杂交袋中，加 5-10 mL Western 封膜液后热密封杂交袋开口。 提供的封膜液只适用于硝酸纤维素膜和 PVDF 膜，不用于尼龙膜。

2. 室温下用脱色摇床摇动杂交袋 30-60 分钟。

三：与一抗二抗结合

1. 用 5 mL Western 抗体稀释液（配制方法：将抗体稀释液成分二干粉到入 成分一溶液中，溶解后即可。未用完的抗体稀释液需-20℃保存）将自备 的一抗稀释至适当的倍数（一般需要稀释 10-100000 倍使用，最佳稀释 倍数跟一抗效价相关，需摸索）。

2. 剪开杂交袋的一角，倒去封膜液，加入 5 mL 新鲜稀释的一抗溶液，加热 密封杂交袋开口。

3. 室温下在脱色摇床上摇动杂交袋 30-60 分钟。

4. 用抗体稀释液将自备的 HRP 或 AP 标记的二抗稀释至适当浓度（一般需要 稀释 500-4000 倍。最佳稀释倍数跟二抗效价相关，需摸索）。

5. 剪开杂交袋的一角，倒去一抗溶液（可留存），加入 5 mL 新鲜稀释的二 抗溶液，加热密封杂交袋开口。

6. 室温下在脱色摇床上摇动杂交袋 30-60 分钟，也可过夜孵育。

7. 剪开杂交袋的一角，倒去二抗溶液（可留存）。

8. 剪开杂交袋，用镊子取出膜，用 Western 洗膜液在器皿中洗 3 次，每次 10 分钟。

9. 根据二抗的标记酶选择下面两种显色方法之一。

五：HRP 显色检测（对 HRP 标记的二抗，本产品 A 型）

1. 将膜平放，在吸附了抗原抗体的一面加入 100-500 uL TMB 溶液 A 和 100-500 uL TMB 溶液 B，铺满整个膜表面（具体用量可按膜的大小增 减）。

2. 置于平式摇荡仪上，在室温下孵育 2 至 5 分钟，直至深蓝色条带出现。

3. 用镊子夹起膜，放入去离子水中洗膜 3 次终止反应，每次 30 分钟。

4. 空气中晾干后照相保存。注意：膜显色后的颜色在数小时后将会褪色，不 能永久存在，故需要及时照相。

六：AP 显色检测（对 AP 标记的二抗，本产品 B 型）

1. 用新鲜配制的 1×AP 缓冲液洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。

2. 将膜转移到新配制的 BCIP-NBT 法 AP 显色液中，每 cm2膜需要 0.1 mL 显色液。新鲜配制 BCIP-NBT 法 AP 显色液（以 10 mL 为例）的方法： 将9 mL 去离子水、1 mL 10×AP缓冲液、50 uL BCIP溶液和50 uL NBT 溶液混匀。此溶液必须在 1 小时内使用。

3. 室温摇晃 5-30 分钟显色（37℃可加速反应）。

4. 显色到合适程度后用自备去离子水洗膜 3 次终止反应，每次 30 分钟。

5. 用吸水纸吸干膜上的水分，避光干燥保存或在一周内照相。

七：Western 抗体清除剂（说明：此处理可能会使蛋白质失去某些表位）

1. 将膜浸泡在 Western 抗体清除剂中，70℃摇晃孵育 30 分钟，去除一抗 和二抗。用 Western 洗膜液洗膜两次，每次 10 分钟。

2. 膜即可用于下一次 Western 检测的膜封堵步骤。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！