吲哚乙酸氧化酶活性检测试剂盒 微量法

吲哚乙酸氧化酶活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前加入 5 mL 蒸馏水备用，2-8℃保存两周。

2、 试剂二：临用前取 1 瓶加入 3 mL 蒸馏水备用，2-8℃保存一周（1 瓶粉剂溶解后可做 100T，为了延长使用时间，此产品多给 1 瓶粉剂）。

3、 试剂三：临用前加入 5.71 mL 50%乙醇（乙醇（V）：H2O（V）=1：1）溶解备用。可以-20℃分装保存两周，避免反复冻融。

4、 试剂五：临用前加入 15 mL 试剂四溶解备用，2-8℃保存两周。

5、 标准品：10 mg 吲哚乙酸。临用前加入 1.14 mL 50%乙醇（乙醇（V）：H2O（V）=1：1）溶解制成 50 μmol/mL的标准溶液，-20℃分装保存两周，避免反复冻融。

产品说明：

吲哚乙酸（IAA）在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破坏失去活性。IAA氧化酶能调节植物体内吲哚乙酸的的水平，从而影响植物的生长。

IAA在无机酸条件下与FeCl3作用生成红色产物，在530nm下有最 大吸收峰。酶活力的大小可用消耗IAA的速率表示。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、超声破碎仪、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、组织：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。

2、细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每 500 万细胞或细菌加入 1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）。12000g，4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至530nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 标准液的稀释：将标准溶液用蒸馏水稀释为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 μmol/mL的标准液。

3、 标准液稀释可参考下表：

4、 加样表：

三、吲哚乙酸氧化酶酶活计算

注意事项：

1、当ΔA大于0.4或者A对照管大于1时，建议将样本用提取液稀释后进行测定；ΔA过小时，可增加酶促反应时间（1h或2h）或增加加入的样本体积来测定。注意同步修改计算公式。

2、试剂一溶解变黑后则不能使用；试剂二有毒性，做好防护措施。

实验实例：

1. 取 0.1g 红豆加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，用 96 孔板测得计算ΔA 测定=A 对照-A 测定=0.477-0.402=0.075，带入标曲 y=2.7049x-0.0154，得出 x=0.0334，按样本质量计算酶活得：

IAA 酶活（U/g 质量）=333×x÷W=333×0.0334÷0.1=111.22 U/g 质量。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！