一、微流控转染
微流控技术指在微米级别进行流体控制，已经用于细胞加工和诊断。具有不同机制的微流控平台已经被开发用于细胞转染，如微注射、细胞挤压、剪切应力、涡旋脱落、确定性机械操作、压缩力、激光、电场。然而，只有少数微流控技术被报道可以成功转染原代免疫细胞（因为原代免疫细胞对转染的抵抗性）。类似于电穿孔，微流控转染可以同时递送不同的药物入胞，如寡核苷酸、大分子复合物（蛋白、碳水化合物）、小分子药物、染料。不像宏观装置，微流控利用微观的膜破裂力，从而可以保留较高的细胞活性。据报道使用微流控菱形微压缩可以产生快速的细胞机械变形，使用GFP质粒可以成功转染30%的SU-DHL-1间变性大淋巴瘤细胞。微流控挤压也能将抗原直接递送进入B细胞，并使B细胞保持较高的活性。微流控电转染通过温和的电脉冲促使细胞通过几十微米的狭窄的微孔道，因而细胞毒性更低。随着对CAR-T产品的需求增加，随之而来对高通量细胞转染的需求也会增加。微流控技术采用连续流和并行模式，相比传统的转染方法更易实现高通量。利用T-junction微孔道中的延伸循环流，悬浮细胞显著拉长，细胞膜变得不连续，从而可以高效摄取纳米材料。另外，超声可以辅助微流控设备实现对原代干细胞和外周血单核细胞（PBMCs）的高通量转染，通过平行和重复的处理转染效率可以进一步提高，这得益于细胞和微尺度膜破坏力之间的接近减少了生物分子扩散进入细胞的时间。同时微流控转染在CAR-T细胞中形成的生物学扰动更少。一项研究发现相比对照组，电穿孔导致促炎因子IFN-γ、IL-2的转录水平分别升高200倍、75倍，而微流控细胞挤压组，这些基因的表达仅升高10倍。更重要的是，转染方式的选择可能会影响CAR-T细胞的治疗效果。虽然，电穿孔和微流控挤压可以达到相当水平的肿瘤浸润，但微流控技术处理的CAR-T有更好的治疗表现。
虽然微流控技术可以提供高通量转染满足细胞大生产的要求，但是运营成本可能会很高。必须保持在微流控孔道中自由悬浮的药物有相对高的浓度，从而可以允许细胞膜孔瞬间开放时足量的药物入胞而实现强效的细胞表达。寡核苷酸类，如DNA，mRNA，siRNA合成相对低廉，但热敏性药物如酶、抗体可能会带来大量的生产和运行成本。虽然微转染对细胞相对温和，微流控通道可能会因为灰尘、细胞、和蛋白的非特异性吸附而阻塞，从而导致转染的中断，造成细胞的损失。对于健康细胞很少的病危病人，这种情况将会给自体CAR-T细胞治疗造成很多不利。现有证据表明实现有效的肿瘤治疗，被转染的CAR-T细胞的质量比数量更重要。鉴于此，是否采用高通量细胞处理值得重新审视。
纳米粒用于细胞转染
纳米粒是粒径在几十到几百纳米的粒子。近年来，纳米粒子由于可编程的特性，已经广泛用于生物医疗诊断，药物递送，造影剂，抗菌剂等。不同大小、形态、和材料组成的纳米粒子已经被设计用于递送不同的药物如：DNA，mRNA，siRNA，蛋白和小分子药物进入不同环境的不同细胞。细胞可以利用不同的内吞机制摄取纳米粒子，如：网格蛋白介导，小窝介导，胞饮作用，胞吞作用。纳米粒子内吞入胞后，它们会困于酸性溶酶体中，到达细胞质之前被释放，再进入目标位点。虽然纳米粒子用于CAR-T细胞转染和改造方兴未艾，但这方面的文献尚少。除了具有吞噬作用的巨噬细胞和中性粒细胞，其他免疫细胞不能从细胞外液中主动摄取材料，因此将纳米粒子递送进入原代免疫细胞并不简单。类似于电转染和微流控技术，纳米粒可以递送不同种类的药物进入细胞（只要药物可以通过静电吸引或共价交联与纳米粒子结合）。生物活性物质被包载或被装载入固体纳米粒，纳米载体被免疫细胞摄取，药物进而在细胞内释放。由于良好的稳定性，脂质纳米粒是用于免疫细胞转染的理想载体。Harashima等基于可电离的阳离子脂质（YSK12-C4）构建了一种包膜型纳米粒，可以将siRNA成功递送进入鼠DCs。基于此，他们用此载体递送siRNA进入人源免疫细胞系包括Jurkat（T细胞），THP-1（单核细胞），KG-1（巨噬细胞），NK-92（自然杀伤细胞NK），实现了高效的基因沉默效率（96%，96%，91%，75%）。粒径小，稳定性高，低聚集性都有利于这些载体的细胞摄取。然而，在KG-1和NK-92细胞上观察到了明显的细胞毒性，这可能是由于阳离子脂质头部造成的细胞膜破裂。还需要进一步的研究减少基于脂质的纳米粒的纳米毒性。除脂质外，聚合物也可用于递送货物进入免疫细胞。聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物（PEG-PLA）纳米粒子被用于递送细胞毒T细胞相关分子-4的siRNA进入CD4+和CD8+T细胞，瘤内递送siRNA增加了细胞毒CD8+T细胞的数量，改善了肿瘤浸润T细胞的抗肿瘤免疫效应。PEG化的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒子可以将抗原递送入DCs，并成功激活CD8+T细胞（Figure b）。Smith等基于可生物降解的聚（β-氨基酯）（PBAE）生产出针对CD19+B细胞的CAR-T细胞（Figure c），这些T细胞可以快速地摄取聚合物纳米粒，在2周时间内维持CAR转基因的高表达，显著改善了淋巴瘤动物模型的生存率。但是，聚合物纳米粒子还要注意阳离子聚合物和基因材料之间的稳定性，体内蓄积（不可降解的聚合物），毒性代谢产物等问题。除了固体纳米粒包裹系统，基于自组装设计的纳米粒也用于转染货物的递送。Yu等使用低分子量的（800Da）聚乙烯亚胺（PEI）和低代数聚酰胺自组装的纳米粒（Figure d）递送质粒DNA，自组装的纳米粒在Jurkat细胞上展现了有效的基因转染和低的细胞毒性，有希望用于CAR-T细胞治疗。同时由于自组装的形成机制，制备程序相对简单，可实现可控释放，但粒子的不稳定性也应该被解决。纳米粒子的一个特别优势在于其可规避病毒载体的免疫原性和电穿孔导致的生物扰动和低转染效率。另外，由于可设计的特征，通过可调节的合成和构造过程，可以改善纳米粒的靶向性和转染效率。Mostaghaci等发现对纳米粒子的不同表面修饰显著影响了与细胞/组织的相互作用，产生不同表现的细胞毒性、免疫激活、降解、和转染。Smith等使用靶向T细胞的抗CD-3e多肽片段、微管相关序列、核定位信号分子功能化的纳米粒，借助微管的作用，递送基因货物进入细胞核。然而，可设计的纳米粒并不总是完美的，Smith团队也发现这种转染方法存在一定的脱靶效应，循环中的中性粒细胞和单核细胞也可以摄取这些纳米粒子，尽管数量远低于目标T细胞。此外，外部因素，如温度也可以影响纳米粒的转染速率。Harashima等发现装载siRNA的脂质纳米粒（LNP）在低温（4℃）条件下的转染效果不佳。可能原因是在低温条件下，靶细胞膜和LNP之间发生的膜融合，减少或抑制了细胞内化。同时，含有对酸/低PH，热，光和磁场敏感的连接键的纳米粒-货物复合物也被构造用于刺激响应的基因递送。相比其他的转染方式，纳米粒子可以减少CAR-T疗法的花费，尤其是用于大生产和转染不同的CAR转基因。许多基于金属的纳米粒子可以通过一步法合成，微流控设备也被认为可以简化纳米粒合成流程，这些可能有助于降低大生产的费用。然而，纳米粒子只能同时递送少数几种货物，当用于递送基因编辑CRISPR/Cas9，纳米粒子的处方组成和合成将会变得更复杂，并且需要更多的试剂和纯化步骤。考虑到GMP生产的需求，这无疑显著增加了纳米粒子用于临床应用的花费。因此，纳米基因递送很大程度上依赖于货物的类型和应用场景，尽管此领域有丰富的文献支持，还没有产品可用于临床细胞转染，可能就是由于难以满足GMP的要求。纳米粒是用于免疫细胞转染的理想工具，尽管已有FDA批准的药物如Onpattro（递送siRNA入肝）。最重要的挑战是货物胞内释放的不可控。经典的入胞途径是纳米粒被摄取进入酸性的内涵体中，但酸性环境可能会降解敏感型货物如DNA。虽然在纳米粒和货物之间引入PH敏感键可以最小化这种局限，但从内涵体释放后，调节DNA进入细胞核仍然是困难的。实验结果显示使用纳米粒进行原代免疫细胞转染仅仅可以实现中等程度的效果（约10—30%的效率）。另一个问题是纳米粒的细胞毒性，尤其是含有金属成分或阳离子脂质成分的纳米粒。为了克服货物在细胞内的不可控释放和运输，经常需要高浓度的纳米粒子，这将导致细胞凋亡，氧化压力，代谢异常，基因表达的改变和细胞器完整性的破坏。大量金属核心纳米粒可能会造成在体内蓄积和器官毒性，大量阳离子脂质（如阳离子头部）可能会破坏细胞膜，导致细胞裂解和坏死。另外，还需要进一步研究纳米粒子如何造成非特异性的目标免疫细胞的增殖或增殖抑制，以及影响疗效。现有研究表明纳米粒相关的转染影响免疫细胞的增殖，而且这种影响与纳米粒类型相关。年老细胞摄取和转运纳米粒的效率显著更低，而且它们也会面临更多的纳米粒造成的生物学扰动压力。然而，来自年老病人（癌症主要发病人群）的免疫细胞转染研究还很少。纳米粒转染免疫细胞的临床应用还需要更多的研究以降低细胞毒性和改善货物在细胞内的释放。三、高比表面积纳米结构转染
高比表面积纳米结构转染
由于过去几十年纳米构造技术的发展，如气液固纳米线合成和原子层沉积，大量的高比表面积纳米结构包括纳米枪，纳米针，纳米线，纳米吸管已经被设计用于细胞内货物的递送。这些纳米结构直径在几百纳米，高度在几微米。区别于其他转染方式的一个典型特征是它们可以与细胞在10-100nm的尺度上相互作用。高度局部化的相互作用和大的比表面积使得这些纳米粒可以应用更直接和强效的外部刺激，如机械力、热、电场（相比微流控）用于细胞质转染。同时，将细胞与纳米粒的交互界面降低到如此小的一个尺度，生物扰动水平降低，细胞活性得以保留，因此更适用于转染敏感型细胞如原代免疫细胞。由于这些特征，各种高比表面积的纳米结构（不同的大小、形状、材料，配合电场和磁场）已经被用于电生理学记录，调节细胞核形态，细胞内取样。类似于其他的物理转染方式，高比表面积的纳米结构可以用于递送不同种类的货物，例如聚核苷酸，蛋白，量子点。10年之前，Park实验组首次提出使用垂直排列的硅纳米线可以将生物药物转导入细胞。纳米线表面包覆核酸和多肽，将免疫细胞培养在表面修饰的纳米线上。这种技术可以成功转染多种免疫细胞，如DCs，B细胞，T细胞，巨噬细胞和NK细胞。纳米结构转染细胞最大的优势在于生物干扰最小，给药后细胞仍能维持非常高的细胞活性（>90%）。纳米结构可以通过几种不同的机制实现货物的细胞内递送，包括直接渗入，局部增强的内吞，外部机械力的加持下的机械穿孔。最近10多年的研究发现，纳米结构的直接渗透是一个低频率的事件，纳米结构-纳米电穿孔的耦合是最常报道的免疫细胞转染方式。最近一项纳米电穿孔技术使用中空纳米管产生高度局部化的电场，形成瞬时的膜孔，将带电荷的货物直接注射进入目标细胞（Figure c）。通过调节试剂的浓度，电脉冲持续时间和电压可以精确控制剂量。不像大面积的电穿孔和微流控电穿孔，纳米-电穿孔所用的电压在量级上更小，从而最小化电流造成的生物学扰动。除了使用电场，Xu等研发了一种基于Au/Ni/Si的磁性纳米枪，可以在磁场的作用下精确地被引入靶细胞，实现高通量的货物递送。相比于传统的非病毒细胞内递送方式，磁性纳米枪展现了更高的无差别的细胞活性（>90%）和转染效率（>80%）。许多选择自体CAR-T治疗的肿瘤病人，通常已经处于肿瘤的晚期，可能没有足量的细胞用于转染。因此纳米结构可以最大限度保留CAR-T细胞的生物学特性，在此方面的应用有很大的价值。然而，高比表面积的纳米结构的转染方法仍然受限于复杂的生产工艺和通量的限制。纳米结构的构造和表征通常涉及多个步骤，如光刻和等离子/化学蚀刻，需要专门的培训和昂贵的设备。最近，Cao等通过利用聚碳酸酯膜和电场实现了非毒性的纳米-电穿孔，有希望成为一种更便宜和简便的纳米-电穿孔技术用于CAR-T细胞改造。大部分使用纳米结构实现细胞内递送的文献没有报道转染通量。Chang等报道使用3D纳米通道电穿孔芯片转染黏附的心肌细胞和纤维细胞，通量为每平方厘米40000个细胞，这个通量是低于其他的转染方法的。CAR-T疗法的更广泛应用，需要这些技术可以进入临床试验，这将会要求转染方法有更高的通量和最小的细胞扰动。
文献来源：Kumar, A. R. K., Shou, Y., Chan, B., K., , Tay, A., Materials for Improving Immune Cell Transfection. Adv. Mater. 2021, 33, 2007421. https://doi.org/10.1002/adma.202007421
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