促进CAR-T转染的材料——病毒转染和电穿孔

病毒转染是目前应用最广泛的转染技术之一。慢病毒和逆转录病毒由于他们相对良好的转染能力和可用性在实验室和临床中广泛应用。据报道，大约94%的临床级别的T细胞生产使用病毒载体（54%使用慢病毒，41%使用逆转录病毒）。根据它们的作用机制，病毒载体可以分为膜融合（单纯疱疹病毒），受体介导的胞吞作用（脊髓灰质炎病毒），直接注射感染免疫细胞（趋向性）。病毒载体可以高效地将转基因整合进入宿主基因组，实现长期的CAR转基因表达。

相比其他的转染方式，生产病毒载体是昂贵的和困难的。同时，从生物学和工程学角度看，病毒转染也阻碍CAR-T疗法成为可负担的和安全的治疗方式。第一个生物学障碍是随机的转基因插入。当插入发生在转录活跃的基因或原癌基因启动子附近时，就有诱导癌症的风险。腺相关病毒（AAVs）虽然不会随意的插入到基因组中，但也有致癌的风险。第二个障碍是使用病毒载体产生毒性。病毒载体可以增强宿主细胞的免疫原性反应。据报道病毒转染会导致原代干细胞的炎症反应、代谢、细胞周期相关的基因表达发生显著改变。转染方法可能会显著影响细胞因子的产生，免疫反应相关基因的表达，表明转染方法和过度活跃的CAR-T细胞之间的潜在相关性。第三个障碍是病毒转染导致的低细胞活性。相比其他转染方式，病毒转染的细胞内钙水平显著增加，表明细胞应激水平的增加。从工程角度看，病毒载体难以递送大分子量的核酸，也难以同时递送不同的货物。CAR随着共刺激结构域和分子开关的加入（改善它们的功能性、持久性和安全性），变得更大更复杂，而大部分病毒载体的载荷上限是7-15kbp。最新的基因编辑技术如CRISPR需要不同组分（gRNA，Cas9 mRNA/蛋白）的同时递送，而大部分的病毒载体一次只能递送一种聚核苷酸。但使用不同的病毒载体又给生产、给药造成了很大的困难（药物在细胞内适时的协同释放）。同时，相比物理转染和纳米材料，病毒转染的GMP生产更复杂。此外，昂贵的病毒载体制造成本限制了对不同患者来源的细胞进行转染能力的高通量筛选和优化。

电穿孔技术使用高压（10-几百伏特）在细胞膜上瞬时穿孔，此时货物通过概率和被动扩散从细胞外液进入胞浆中。目前商业化的转染设备有预设的程序，但是没有电流参数的信息（如电场强度、频率、波形），这使得通过单细胞RNA测序快速获得的新型细胞类型的转染优化颇具挑战。相比病毒载体，电穿孔可以同时用于聚核苷酸和蛋白的转染。但是当货物分子过大时，它们将无法通过膜孔扩散。另外，带电荷的货物可以通过电泳力进入细胞。电穿孔技术已经用于递送DNA和mRNA实现CAR蛋白的瞬时表达。特定细胞标记的细胞分选可以通过流式细胞仪观测，使用荧光信号进行筛选。分离转染的细胞可以检测是否转染的基因在一段时间内是稳定的，下游使用成功转染的细胞可以获得更高的抗肿瘤效果。同时电穿孔可以同时递送不同类型的货物，因此兼容现行的基因编辑技术。据报道外源的纳米粒或生化制剂难以转染原代免疫细胞如DCs，但电穿孔技术可以成功地将mRNA递送入小鼠DCs。

然而，电穿孔技术导致的恶劣条件可能会影响细胞的生物学功能。据报道电穿孔转染显著增加了细胞的应激水平，延迟了原代免疫细胞的扩增时间，诱导异常的细胞因子水平和基因表达。相比病毒转染，电穿孔的转染效率较低，由于DNA整合进入宿主细胞基因组的概率更小，CAR的表达会随着时间而降低。对此，电穿孔转染需要更高的给药浓度，这进而导致细胞毒性的增加。

电穿孔导致的生物学扰动可能来源于应用强力的、非同源电场造成的焦耳热和低细胞活性。同时在电穿孔过程中电场的变化会导致不同膜孔的形成，这些膜孔的开放时间窗不同，从而导致一个细胞群的转基因表达不同。为了保持细胞在电穿孔过程中的活性，一些公司在电转染装置中引入孔径在几厘米到几毫米之间的微流控芯片（如4D核转染比色皿），从而可以降低所需的电压和产生的焦耳热。