ELISA(免疫酶联吸附实验)是免疫学基础实验之一,大部分生命科学领域的科研工作者对其都不陌生。因为其特异性强,灵敏度高,可精确定量的特性,在基础科研和临床诊断中,ELISA技术都应用广泛,相信很多关注我们的小伙伴也都做过ELISA。
ELISA实验步骤少,流程短,购买的即用型试剂盒也都有指导性很强的操作说明书,单次实验3-6小时即可得到结果,实验小白也可以很快的上手。但是,各位同学可不要轻视哦,ELISA和WB、IHC等基础免疫实验一样,都是易学难精,上手容易,但想要得到稳定的结果,还是要花一点心思的。小编在这里汇总了一些做ELISA的客户咨询我们的问题,把其中有代表性的集中做成了FAQ,大家快看看这其中有没有困扰你ELISA实验的问题吧~
Q: ELISA可以检测胞内蛋白么?
A: 可以的,大部分ELISA指标均为炎症因子、趋化因子等分泌类型蛋白,支持的样本类型也多为血清、血浆、细胞培养上清等液体样本。如需检测胞内蛋白,首先需要确认待测指标是否在胞内表达,然后选用支持组织匀浆样本的ELISA试剂盒即可,将组织样品或细胞样品进行裂解,提取胞内蛋白后进行蛋白定量,保证每孔上样总蛋白量一致即可。
Q: ELISA可以测DNA的表观么?
A: 不可以,ELISA是利用免疫学原理,定量检测蛋白质表达的技术。测DNA表观遗传学,主要是检测DNA甲基化,可以选用ChIP技术。
Q: 夹心法ELISA实验中的捕获抗体和检测抗体是同一个抗体么?
A: 不是的,在双抗夹心法ELISA实验中,会同时用到捕获抗体和检测抗体,这两个抗体是针对同一抗原蛋白的不同抗原位点的两种抗体,这样才可以同时结合抗原分子。这也是双抗夹心法ELISA不适用与小分子抗原和半抗原等待测指标的原因。
Q: 试剂盒里面有捕获抗体么?
A: 即用型ELISA试剂盒中,捕获抗体已经预包被至试剂盒中的ELISA板上,没有单独的捕获抗体提供,直接使用ELISA板孵育稀释后的样本及标准品即可。非即用型的ELISA试剂盒会有捕获抗体提供,需按照说明书推荐的工作浓度,用稀释液稀释后自行包被。
Q: 捕获抗体如何包被在96孔板上?
A: 如果选用的是即用型ELISA试剂盒,无需进行抗体包被,因为试剂盒中的检测抗体已经事先包被在检测板中;如果是非即用型的ELISA试剂盒,需要自己在实验前提前进行抗体包被,简要步骤入下:首先,要选择ELISA级别的板子,材质应为聚苯乙烯;然后用抗体包被液将捕获抗体稀释(pH9.6的碳酸盐缓冲液或pH7.2的PBS或pH7-8的Tris-HCl)成工作浓度,再每孔加100 μl(96孔板加样量)稀释后的捕获抗体,室温或4℃过夜包被,然后进行洗板和封闭之后再次洗板即可使用,如需长期保存,则需要真空冻干后保存。
Q: ELISA实验中,酶标抗体是什么抗体?识别的目标又是什么?
A: 这个问题需要具体分析,在直接法ELISA中,酶标抗体直接识别抗原,即可检测,但缺少二抗放大,且灵敏性不高。在间接法ELISA中,酶标抗体作为二抗,识别检测抗体。而在目前应用最广的双抗夹心法ELISA中,酶标抗体识别的也是检测抗体,对检测抗体进行识别和酶标记。
Q: 试剂盒有推荐样本稀释浓度还需要自己测吗?
A: 试剂盒一般会给出不同样品类型的的推荐稀释比例,但是为大致范围,最好还是根据自己的样本情况,设计预实验测量计算。尤其是待测蛋白为炎症因子时,因为在不同组别样本间差异巨大,更是需要预实验检测后稀释。
Q: 做实验前怎么知道待测血清中炎症因子的范围呢?多大是高多小是低?
A: 需要根据文献推测,一般在健康人样本中,炎症因子表达很低,接近ELISA检测下限,样品无需稀释或1:1稀释即可,如已知为炎症疾病或造模样本,可参考文献,在预实验中设置1:10-100(或更高)的稀释比例,预实验检测后确定最佳浓度进行正式实验。
Q: ELISA实验中,检测计算抗原的浓度,临界值怎么确定?
A: 根据曲线测定的浓度,建议落在标准曲线的中间位置较好,极限最好不要超过标准曲线的上下限,如果超出较多,会影响计算结果准确性,建议调整稀释比例。
Q: 配好的抗体没用完如何保存,可保存多久?预实验用了一个试剂盒里面的部分板子和试剂,剩下的板子和试剂还能继续用于正式实验吗?
A: 针对爱必信的ELISA试剂盒来讲,在说明书中有各组分拆开后的保质期,配好的母液和拆封的板子,可以在四度保存,保质期为一个月左右。剩下的板子和试剂在保质期内是可以继续用于正式实验的,为保证实验质量,还是建议间隔时间不要太长,一周之内更好,需注意试剂避免污染,板子保持干燥。
篇幅所限,小编在这里先放上关于ELISA原理、样本和预实验的10个问题,后续实验操作及数据分析方面的问题会在接下来的文章中分享,感兴趣的小伙伴们继续关注吧~
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