细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒　

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产品描述：

产品名称：细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒　

描述:

    细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或组织中抽提细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白的方法。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。

使用方法: 实验流程：
1、对于贴壁细胞：用 PBS 洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用 EDTA 溶液处理细胞使细胞不 再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备 用。尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
2、对于悬浮细胞：用 PBS 洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。 3、对于组织：把组织尽可能切成非常细小的碎片。
4、在200mg的组织或细胞沉淀中加入冰上预冷的480μl细胞浆蛋白抽提缓冲液(Reagent A), 10μl 磷酸酶抑制剂(Reagent D) (50×)，10μl 蛋白酶抑制剂(Reagent E) (50×) (48:1:1)；
5、用手提式均浆器均浆。悬液在 4℃下，孵育 10 min；
6、4℃下，14000rpm 离心 10min；细胞上清液转移至新的 eppendorf 管中，为胞浆蛋白。可以立 即使用，也可以冻存；(千万不要触及沉淀，可在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。) 7、对于组织样品：到这一步已充分匀浆，但还有一些细胞没有破碎。接下去按照使用说明的步 骤 4 开始操作，将两次得到的胞浆蛋白合并，为胞浆蛋白。可以立即使用，也可以冻存；
8、可选择：加入 10μg/ml DNase，然后在室温下孵育 30min~2h，孵育的时间取决于由 DNA 引 起的粘性的消失而定。如果样品所含的 DNA 不影响核蛋白的抽提，可忽略此步，直接进入下 一步；
9、用 300μl 细胞浆蛋白抽提缓冲液(Reagent A)洗涤沉淀 2 次；
10、然后用冰上预冷的 192μL 细胞核蛋白抽提缓冲液(Reagent B), 4μl 磷酸酶抑制剂(Reagent D) (50×)，4μl 蛋白酶抑制剂(Reagent E) (50×) (48:1:1)裂解细胞沉淀；
11、悬液在 4℃下，孵育 10 min；
12、4℃下，14000rpm 离心 10min，细胞上清液转移至第二个新的 eppendorf 管中，这是胞核蛋 白。可以立即使用，也可以-70℃冻存。 13、用 300μl 细胞浆蛋白抽提缓冲液(Reagent A)洗涤沉淀 1 次；
14、然后用冰上预冷的 192μl 细胞膜蛋白抽提缓冲液(Reagent C)，4μl 磷酸酶抑制剂(Reagent D) (50×)，4μl 蛋白酶抑制剂(Reagent E) (50×) (48:1:1)裂解细胞沉淀；
15、悬液在 4℃下，孵育 10 min；
16、随后超声处理 10sec；
17、 4℃下，14000rpm 离心 10min，细胞上清液转移至第三个新的 eppendorf 管中，这是细胞膜 蛋白。可以立即使用，也可以-70℃冻存。

储存/保存方法: A、B、C组分应在2~8℃保存；D、E组分应在-20℃保存。有效期12个月

注意事项: 1、抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或 4℃进行（除 DNase 作用外）；在使用前 1min，将蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂加入至细胞质、细胞核蛋白抽提缓冲液中； 2、DNase 需要用户自备； 3、使用本试剂盒抽提到的细胞浆、细胞核蛋白均可用爱必信的 BCA 蛋白定量试剂盒测定其浓度； 4、为了您的自身安全，使用试剂前，请做好防护，如穿实验服，带手套等。

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