利用多对引物/探针分析比较qRT-PCR和ddPCR两种方法对SARS-COV-2检测
Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets
发表期刊:Emerging Microbes & Infections 2020
影响因子:6.9
作者单位:a State Key Laboratory of Virology, Modern Virology Research Center, College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;
b State Key Laboratory of Virology, Renmin Hospital, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;
c Department of Infectious Disease, Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China;
d Frontier Science Center for Immunologyand Metabolism, Wuhan University, Wuhan, People’s Republic of China
研究目的
通过使用不同的引物探针对比较qRT-PCR和ddPCR两种检测方法对SARS-COV-2的检测情况。
研究背景
SARS-CoV-2的大流行对临床病原体诊断提出了迫切的要求。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定法是检验的金标准,已被广泛用于快速检测SARS-CoV-2感染。但是,qRT-PCR结果不准确的问题日益暴露,qRT-PCR的假阴性报告(FNR)不可避免的,这可能会影响及时诊断,早期治疗,预防传播和评估出院标准。液滴数字PCR(ddPCR)用于SARS-CoV-2核酸检测的补充使用可以最大程度地减少FNR。
研究人群和样本采集
本研究中,我们使用健康人和SARS-CoV-2感染患者的鼻咽拭子cDNA,在相同条件严格比较了8种常用的引物/探针组的qRT-PCR和ddPCR的性能。
实验结果
图1A为RT-PCR检测结果,在健康人样本为阴性对照,其中引物对UCDC-N1、UCDC-N2、CCDC-N CT值<40表明有非特异性扩增这样易导致10−4和10−3稀释的低病毒载量的样本检测结果易出现假阳性, 相反,在没有非特异扩增的引物探针对中, UCDC-N3,HKU-,Charité-E和HKU-ORF的检测低载量的病毒样本时,易出现假阴性。并且根据结果来看最灵敏的引物探针对CCDC-ORF在10−4稀释时可以检测到3/10(30%)阳性样品。另外,引物探针对CCDC-ORF在病毒载量低时CT值范围从35.5到39.4,一致性较差,在病毒载量较高时结果一致性较好表明qRT-PCR仍然是检测正常病毒的可靠方法。
图B表示使用相同引物/探针组的ddPCR结果,表明ddPCR在低病毒载量样本的检测总体上有所改善。健康样本对照中,尽管显示UCDC-N1和N2有扩增背景但它们仍然可以区分低病毒载量样品(稀释10−4)。此外,虽然UCDC-N3,HKU-N和CCDC-N显示较低的非特异性扩增背景,Charité-E,HKU-ORF和CCDC-ORF没有任何非特异性扩增,但是,所有低病毒载量的样本都可以产生正确的阳性报告。因此,ddPCR可以在病毒载量较低时,可以显着减少检测中的FNR和FPR。
图1. 不同引物/探针组的qRT-PCR和ddPCR结果
(A) 使用不同引物/探针组进行qRT-PCR的结果。横坐标为稀释倍数(转换为log10),纵坐标为Ct值, ND为阴性CT值≥40。
(B) 使用不同引物/探针组的ddPCR结果。横坐标为稀释倍数(转换为log10)纵坐标为拷贝数。ND为阴性0拷贝。对于每个引物探针组,绿色阴影区域为健康人的样本(IgM / IgG阴性),超出该阈值为阳性。
结果讨论
结果表明,与qRT-PCR相比,ddPCR方法可显着减少不准确的结果,包括FNR和FPR。同时,由于qRT-PCR这种标准检测方法易出现FNR或FPR,对于SARS-COV-2临床检测的更好选择是核酸测试。
结合成像,血清测试以及经验丰富的临床医生的判断,而不是仅仅依靠qRTPCR。总之,qRT-PCR适用于大规模诊断正常病毒载量样本中病毒感染的检测。但是,对灵敏度和精度有特殊要求的定量ddPCR将是更理想的方法。
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