【分享】银鲳鱼的种属鉴定与定量研究

银鲳鱼的种属鉴定与定量研究

Species identification and quantfication of silver pomfret using the droplet digital PCR assay

期刊：Food Chemistry

影响因子：5.399

通讯作者单位：Institute of Food Safety and Nutrition, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong, China.

College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510641, Guangdong, China

【背景】

银鲳鱼（Pampus argenteus）是一种经济价值高的物种，中国有巨大的市场需求。近年来，由于高强度的捕捞，银鲳鱼的数量有所下降，为了维持利润，一些制造商已经采取了用更便宜的鱼代替银鲳鱼，进行食品的造假、掺假。

【目的】

开发一种准确的方法来识别银鲳鱼食品，减少食品造假、掺假的非法行为。

【实验材料】

银鲳鱼和金鲳鱼， 两种鱼按照比例分别为0.1%、0.5%、1%、10% 和50% 进行混合， 即混合物中含有0.1g银鲳鱼/99.9g金鲳鱼、0.5g银鲳鱼/99.5g金鲳鱼、1g银鲳鱼/99g金鲳鱼、10g银鲳鱼/90g金鲳鱼，还有50克银鲳鱼/50克金鲳鱼。

【实验设计】

①筛选ddPCR引物和探针；

②特异性测试；

③引物和探针之间浓度比筛选；

④熔融温度筛选；

⑤PCR循环数筛选；

⑥qPCR对比测试。

1.筛选ddPCR引物和探针

CY-1 细胞色素氧化酶Ⅰ亚基（COI）

CY-2 细胞色素B（cytb）

CY-3 16srrna

对三组引探进行测试，CY-2、CY-3无扩增产物，故本实验采用CY-1组引探。

2.特异性测试

银鲳鱼液滴数字PCR检测的特异性检验。{ 样品说明如下： PC， 阳性对照（ 银鲳鱼）；NC， 阴性对照（ 无菌蒸馏水）；1.卵状细鳞鲷；2.无节圆鳃鲷；3.点状圆鳃鲷；4.圆头鲷；5.中国对虾；6.灰鲷。

3.引物和探针之间浓度比筛选

不同的引物与探针浓度进行实验对比，最终选取了300：200、300：300、400：200三种浓度比进行下一步测试。

4.熔融温度筛选

对实验③的三种不同浓度的探针进行TM筛选，最终选定56℃、57℃、58.2℃三个温度来进行下一步测试。

5.PCR循环数筛选

对实验④的三个温度进行循环数筛选。

九种组合的银鲳鱼液滴数字PCR反应结果的正交设计，最终确认每个引物400nmol/l，水解探针200nmol/l，PCR扩增程序：95°C10 分 钟 ；然后50次循环94°C 30s ，50 ℃1min，98℃10min。

6. qPCR对比测试结果

qPCR的检出限约为313copies，而ddPCR其中一些LOD数值范围为1至5copies。

【总结】

①用ddPCR和qPCR系统检测了银柚和金柚的不同肌肉混合物和DNA混合物，并对结果进行了比较，发现两种方法检测结果是高度一致的。在不需要制定标准曲线的情况下，ddPCR的检测结果能精确定量。

②由于缺乏标准物质，qPCR 难以对食品掺假进行定量，所以进行绝对定量的ddPCR是在这方面具有一定的优势。

③ddPCR的精准度比qPCR高。

【结论】

ddPCR与qPCR各有优劣，在效率方面，qPCR的效率比ddPCR高，但在精确性方面，ddPCR系统具有优异的灵敏性，对样本能进行准确的定量，适合执法机构对食品进行精确检测。目前还没有准确和有效的方法来识别鱼类，使用ddPCR去进行检测食品是可行的，该方法可以成为执法机构和渔业相关机构的宝贵工具，并解决食品掺假问题。

关于我们

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永诺医疗是永诺生物的全资子公司，以“中国智造”为己任，专注于数字PCR仪器与应用试剂的研发，并于2017年成功研发了国内首款拥有完全自主知识产权的MicroDrop®系列微滴式数字PCR系统并投入生产。