【设备更新】MST技术在核酸检测中的解决方案

方案标题：MST技术在中药成分靶点检测中的解决方案

检测样品：核酸

检测项目：结合亲和力

应用领域：病毒学；RIBOTAC

方案摘要：

核酸适配体是指通过SELEX筛选得到的能与靶标高特异性、高亲和力结合的单链DNA或RNA。目前国内外具有高亲和性和高特异性结合的小分子靶标的核酸适配体很少，主要原因有：1. 小分子靶标的适配体难以筛选；2. 小分子靶标与其候选适配体亲和力表征方法难以确定。

亲和力表征是确定适配体筛选成功与否的关键步骤，RNA分子量小，体外容易降解，而Monolith系列分子互作仪对分子量无限制，同时10分钟的快速检测可以最大程度避免RNA的降解。

方案详情:

MST应用案例——蛋白质和小分子互作

Monolith助力靶向RNA降解剂研究

人类基因组中仅有1%是负责蛋白质编码的基因，其中疾病相关的蛋白大约有 3000个，只有不到700种被目前获批的药物作为靶点，绝大多数疾病相关的蛋白被认为是不可靶向的。针对疾病相关的非编码RNA以及不可成药的蛋白靶点，使用小分子靶向RNA的结构是治疗相关疾病的一种策略。小分子靶向RNA所遇到的挑战是RNA的目标占有率通常不足以引发生物活性，仅依靠小分子对RNA结构的占据通常不足以引发生物学效应。

2023年5月24日，Scripps研究所的Matthew D. Disney教授及其合作者在Nature杂志发表了题为“Programming inactive RNA-binding small molecules into bioactive degraders”的研究论文，利用核糖核酸酶靶向嵌合体靶向降解癌症靶标MYC、c-JUN和MIR155的RNA。

研究人员基于二维组合筛选进行RNA和小分子高通量分子间相互作用检测，发现了一些可以与pre-miRNA-155结合的小分子。接下来使用Monolith分子互作仪完成了大量RNA小分子结合表征。研究人员验证了C1仅结合于5′GAU/3′C_A motif，其他RNA凸起或者点突变RNA在相同检测浓度范围内看不到明显的结合信号。在使用Monolith检测时无需固定RNA，仅需带有CY5标记即可直接在溶液中精确表征Kd，检测一对样品仅需10min。

图1. pre-miR-155-binder C1结合曲线

小分子结合于pre-miRNA-155的非活性位点，并不会对细胞内的miRNA-155表达水平产生影响。接下来研究人员构建了双功能小分子核糖核酸酶靶向嵌合体，一端与目标RNA结合，另一端招募并激活RNA酶，从而靶向降解目标RNA。改造后的嵌合体成功在细胞内降低miRNA-155的表达水平，并且在细胞和小鼠模型中抑制了三阴乳腺癌。

图2. 将结合pre-miR-155的惰性结合物转化为活性RIBOTAC降解剂

为了测试该方法的适用性，研究人员又构建了靶向MYC和JUN的核糖核酸酶靶向嵌合体。这两种蛋白都是重要的癌症靶点，但都是无序蛋白，被认为是不可成药的。改造后的核糖核酸酶靶向嵌合体获得了生物活性并在细胞内精准地靶向降解各自的靶向RNA，使这些癌蛋白驱动的转录和蛋白组学进程失效。这项研究表明对于由这些常见但具有挑战性的致癌基因驱动的癌症，重编程非活性小分子为靶向RNA降解剂可能会带来新的变革。

图3. JUN-RIBOTAC选择性降解JUN mRNA抑制胰腺肿瘤细胞的增殖和迁移

CRISPR-Cpf1识别剪切RNA的分子机制

CRISPR-Cas 系统是细菌编码的适应性免疫系统，该系统通过RNA 引导的效应蛋白剪切病毒的DNA 或者RNA，从而抵抗病毒的感染。

哈尔滨工业大学黄志伟教授实验室解析了crRNA 和蛋白Cpf1 复合物的晶体结构，发现一个紧密结合crRNA 的六水合镁离子对稳定crRNA 构象，激活Cpf1 的催化活性非常关键。MST 试验数据表明缺失这个镁离子后，Cpf1 与crRNA 的亲和力下降了约70 倍。

此后黄志伟教授还在另一篇论文里研究了SpyCas9-sgRNA 复合物与PAM DNA 以及AcrIIA2 和AcrIIA4 蛋白的相互作用，从分子水平阐明了AcrIIA2 和AcrIIA4 蛋白通过竞争结合的方式抑制SpyCas9 介导的目的DNA 剪切。

Dong, D. et al. The crystal structure of Cpf1 in complex with CRISPR RNA. Nature 532, 522-526, doi:10.1038/nature17944 (2016).

Dong et al. Structural basis of CRISPR-SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein. Nature 546, 436-439, doi:10.1038/nature22377 (2017).

核酸适配体检测霉菌毒素

核酸适配体（Aptamer）是一段能特异结合配体分子的核苷酸序列。相比于抗体，核酸适配体具有稳定性高、易于合成等多种优点。

赭曲霉毒素A 是继黄曲霉毒素后又一个引起世界广泛关注的霉菌毒素，有肾脏毒、肝毒、致畸、致癌、致突变和免疫抑制作用。使用核酸适配体检测食物中的赭曲霉毒素A 具有非常大的应用前景。德国汉诺威大学的研究人员应用MST 技术，研究了核酸适配体1.12.2 与赭曲霉毒素A 在多种复杂条件下的相互作用。试验结果表明，随着啤酒浓度的提高，二者的亲和力明显下降（从32 nM 下降到4808 nM）；研究人员同时在咖啡、果汁和红酒环境中检测了二者的结合。试验结果充分体现了MST 技术对测试条件没有限制这一优点。

Schax, E. et al. Aptamer-based depletion of small molecular contaminants: A case study using ochratoxin A. Biotechnology and Bioprocess

Engineering 20, 1016-1025, doi:10.1007/s12257-015-0486-1 (2015).

Skouridou, V. et al. Aptatope mapping of the binding site of a progesterone aptamer on the steroid ring structure. Analytical biochemistry 531, 8-11, doi:10.1016/j.ab.2017.05.010 (2017).