【设备更新】MST 技术在中药成分靶点检测中的解决方案

方案标题：MST技术在中药成分靶点检测中的解决方案

检测样品：蛋白

检测项目：结合亲和力

应用领域：药学

方案摘要：

中药成分及天然产物的药效是通过与多个靶点的相互作用来实现的，它们与靶蛋白瞬时、弱亲和力相互作用，这种作用机制的复杂性为其靶点鉴定带来很大挑战。

传统的基于亲和力的靶点垂钓方法取决于小分子化合物和靶点蛋白质的亲和力，这种结合需要足够强，以便从整个蛋白质组中分离目标蛋白质，而NanoTemper的微量热泳动技术（MST）检测结合亲和力的范围非常广，可发现从皮摩尔级 (pM) 到毫摩尔级 (mM) 的极强和极弱结合分子。

方案详情:

MST应用案例——蛋白质和小分子互作

葫芦素B诱导GRP78-FOXM1-KIF20A通路介导的结膜黑色素瘤细胞G2-M细胞周期停滞

结膜黑色素瘤 (Conjunctival Melanoma，CM) 是一种罕见且致命的黑色素细胞恶性肿瘤，位于眼表。它约占所有眼部肿瘤的2%和所有非皮肤黑色素瘤的1.6%。CM在人群中发病率低，发病机制极其复杂，潜伏期长，因此更难治愈。大多数CM源于原发性获得性黑变病 (Primary acquired melanosis，PAM) 或结膜色素痣。但迄今为止，关于CM的遗传和表观遗传特征还没有更深入的阐明。

2022年10月，华东理工大学药学院李剑教授与上海九院眼科徐晓芳/贾仁兵教授团队合作在Acta Pharm Sin B（IF=14.903）上发表了题为“Cucurbitacin B-induced G2-M cell cycle arrest of conjunctival melanoma cells mediated by GRP78–FOXM1–KIF20A pathway”的研究论文，揭示了葫芦素B能够抑制结膜黑色素瘤直接靶点及其作用机制。

https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.05.021

葫芦素B (CuB)是最丰富和最常研究的葫芦素衍生物之一，它是从葫芦科植物中分离出来的四环化合物。作为一种传统药物，CuB具有多种药理活性，如抗炎、解热、抗糖尿病和抗癌活性，这些活性由不同的调节信号通路介导。在中国，CuB已被用作慢性肝炎和原发性肝癌的辅助治疗药物。在此研究中，作者通过细胞学实验第一次发现CuB能够显著抑制具有典型NRAS和BRAF突变（包括CRMM2、CM-AS16、CRMM1 和 CM2005.1）的CM细胞的增殖，而对正常细胞无毒性。

为了确定CuB的直接作用靶点，作者采用ABPP（Activity-Based Protein Profiling）的化学蛋白质组学策略，筛选到GRP78蛋白鉴定为潜在靶标。GRP78已被验证为多种癌症的潜在生物标志物和治疗靶点，可抑制癌细胞的进展、增殖、侵袭和转移。接下来作者需要通过直接的实验证据证明筛选得到的GRP78蛋白为CuB的直接靶点。

作者首先通过热位移（TSA）结合测定证明，与对照相比，使用CuB处理过的样品(0.2 mmol/L) 以温度依赖性方式增加细胞裂解物中GRP78的热稳定性（图1），表明GRP78和CuB之间可能存在直接相互作用。

图1注：CuB与 GRP78 过表达 293 T 细胞 的细胞热转移结合测定。

之后，评估CuB与GRP78的亲和力，团队使用了NanoTemper的Monolith NT. Automated分子互作仪进行MST检测，结果显示CuB与GRP78的亲和力为0.11 μmol/L（图2，红色曲线），与细胞活性一致。MS/MS分析表明，在经过CuB处理的重组GRP78样品中，GRP78的Lys326位点存在α-β--不饱和酮修饰。作者检测CuB与突变体 GRP78 (Lys326Ala) 的亲和力明显减弱，其Kd值为 25.40 μmol/L（图2，蓝色曲线）。综合其他实验，证明了CuB通过α-β-不饱和酮部分与GRP78相互作用。

图2注：通过MST检测CuB与人重组GRP78蛋白（WT 和突变体）之间结合亲和力。

“靶向降解组学”鉴定中药成分靶点

中药活性成分和其作用靶点的鉴定均在中药研发领域具有重要的科学意义和实用价值。尤其是靶点鉴定，它是理解中药机制和下游药物开发的基础和关键。但由于中药“多靶点、多成分”的作用模式，以及与靶点蛋白瞬时、弱亲和力的相互作用，导致中药的靶点鉴定存在巨大挑战，亟需研究的思路创新和技术创新。

沈阳药科大学陈丽霞和李华团队创造性地将PROTAC技术引入到了中药研究领域。研究人员在前期研究中从中药千金子中获得了一系列千金烷二萜类化合物，其中ZCY-001化合物具有最强的抗炎活性，并且具有低毒性。将该化合物的核心骨架Lathyrol（即千金子二萜醇）与沙利度胺 (E3连接酶CRBN配体) 通过PEG linker相连，得到了PROTAC分子ZCY-PROTAC。使用该PROTAC分子对细胞进行处理后提取蛋白，并使用TMT串联质谱标签进行标记定量蛋白组学分析（图A）。比较蛋白组学分析发现MAFF蛋白在ZCY-PROTAC处理后发生了最为显著的降解。Western Blot结果也显示, MAFF蛋白的降解水平与ZCY-PROTAC的剂量和作用时间是正相关的（图B）。研究人员使用Monolith直接检测了Lathyrol及其衍生物ZCY020与MAFF蛋白的亲和力，证实了MAFF蛋白是中药千金子成分的直接作用靶点。

Wu Y, Yang Y, Wang W, et al. PROTAC Technology as a Novel Tool to Identify the Target of Lathyrane Diterpenoids. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2022 Jul 16.

中药小分子抑制剂作用机制

Wnt/β-catenin信号通路是公认的肿瘤驱动因子，但β-catenin缺乏常见的小分子结合深疏水口袋，是个典型的“不可成药”蛋白。上海中医药大学的研究人员发现中药路路通活性分子路路通酸 (LDA) 抑制Wnt信号通路和结肠癌，并利用蛋白质谱技术找到了LDA的潜在靶标蛋白肿瘤坏死因子受体相关因子2 (TNF receptor-associated factor 2，TRAF2)。接下来研究人员使用Monolith分子互作仪验证了TRAF2与LDA的直接相互作用。为了进一步探究LDA的结合位点，研究人员表达了不同结构域的GFP标签蛋白直接在细胞裂解液中检测。结果显示LDA与缺少TRAF-C domain以及删除TRAF-C domain 408–431氨基酸（△408–431）的蛋白间并无相互作用，仅与TRAF-C domain（TRAF2-TC）作用（右图）。

Yan R, Zhu H, Huang P, Yang M, Shen M, Pan Y, et al. Liquidambaric acid inhibits Wnt/beta-catenin signaling and colon cancer via targeting TNF receptor-associated factor 2. Cell Reports. 2022;38(5).

MST应用案例——蛋白质和酶互作

MST技术检测蟾毒灵与E2F2转录因子间的相互作用

转录因子E2 因子 (E2F) 家族是参与细胞周期及细胞凋亡的重要调节因子。作为E2F家族的重要成员，E2F2的异常表达总与各种癌症的不良预后高度相关，例如，E2F2水平在晚期肝细胞癌中普遍上调，E2F2高表达的患者生存率普遍较低，这表明E2F2具有成为抗癌靶标的潜在价值。因此，选择性抑制E2F2功能的潜在治疗策略的发现引起了广泛关注。然而E2F2 作为转录因子，缺乏典型的配体结合域，传统上被认为是“不可成药”的靶点。分子胶是一类小分子，可以诱导蛋白质-蛋白质相互作用，以驱动以前不可成药的蛋白质降解。但到目前为止，仍未见有关具有选择性 E2F2 靶向特性的分子胶的报道。

为了探索 E2F2 降解策略，北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室屠鹏飞与曾克武团队使用中药蟾酥主要活性蟾毒灵（Bufalin，BF）作为化学探针来确定其在肝细胞癌 (HCC) 中的药理作用。结果表明，一种新的非典型E3连接酶ZFP91可作为降解E2F2转录因子的药物靶点。此外，实验发现蟾毒灵具有分子胶的功能，可以有效诱导转录因子E2F2与非典型泛素连接酶ZFP91形成E2F2-ZFP91-蟾毒灵三聚体复合物，进而促进E2F2的泛素化和蛋白酶体途径降解。

此文章于2022年11月发表在eBioMedicin：https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2022.104353

在这项研究中，NanoTemper的微量热泳动MST分子互作技术被用于检测蟾毒灵作为分子胶水分别与E2F2和ZFP91的亲和力（图1）。

图1注：蟾毒灵招募ZFP91降解E2F2的作用模式

MST技术可以在细胞裂解液中检测目的蛋白和另外分子的互作，即可免纯化。对于难纯化的蛋白来说，仍可完成定量亲和力的检测。该研究中在裂解液中目的蛋白通过2种不同的方法带上荧光，完成复杂环境中目的蛋白与其他分子的准确亲和力测定。

在检测E2F2与蟾毒灵互作时，构建了带有his-tag标签E2F2质粒，在HEK293T细胞中过表达。裂解后，使用NanoTemper RED Tris-NTA试剂盒特异性标记裂解液中his-tag E2F2，使其带上荧光，然后向裂解液中加入梯度稀释的蟾毒灵。微量热泳动 (MST) 实验表明，蟾毒灵直接与E2F2结合，解离常数为3.15 ± 1.43 μM（图2）。

图2注：MST检测裂解液中E2F2与蟾毒灵的亲和力

在检测蟾毒灵与ZFP91互作时，作者构建pEGFP-N1-ZFP91质粒转染导HEK293T细胞中过表达，裂解后取上清，将上清液中的EGFP-ZFP91直接作为荧光信号源，加入梯度稀释的蟾毒灵。MST测定显示蟾毒灵以 462 ± 146 nM的解离常数（Kd）与ZFP91结合（图3）。

图3注：MST检测裂解液中ZFP91和蟾毒灵的亲和力

蟾毒灵可拆分成α-吡喃酮（α-Pyr）与DHA两个结构，团队通过MST实验证明α-Pyr直接与ZFP91蛋白结合（Kd = 900 ± 322 nM），但不与ZFP91的C349A突变结合（Kd未检测到）（图4），表明α-Pyr是蟾毒灵与ZFP91发生结合的关键基团。综合其他结果，团队提出蟾毒灵可以作为分子胶介导E2F2-ZFP91复合物的形成，进一步促进E2F2的泛素化和降解。

图4注：MST 展示了α-Pyr和GFP-ZFP91之间的直接相互作用

总的来说，这项研究进行了基于分子胶的E2F2癌症治疗靶向策略的概念验证，在癌症治疗中具有广阔的药用价值。同时，该研究还揭示了蟾毒灵作为天然“分子胶水”发挥抗肿瘤作用的独特药理机制，也为抗肿瘤药物的设计提供了具有中医药特色的新颖靶点与先导药物分子。