NanoTemper工具为您的膜蛋白研究排忧解难！

NanoTemper工具为您的膜蛋白研究排忧解难！

● 研 究 难 点

在药物开发和结构生物学研究领域中，有许多重要的靶点属于膜蛋白，例如G蛋白偶联受体(GPCRs)，离子通道和膜转运蛋白等等，涉及多种生化功能和疾病发生机理，因此一直是研究人员关注的热点。

然而，膜蛋白的研究存在着不少难点。让我们来看看NanoTemper公司的技术是如何帮助研究人员克服膜蛋白研究中的难题吧！

难题 1

膜蛋白难以纯化，需要用去垢剂溶解，但有效提取膜蛋白的去垢剂不一定适宜纯化及下游的生化实验，需要快速且高通量筛选去垢剂的方法。

欧洲分子生物学实验室的研究人员利用nanoDSF和Backreflection技术开发了一套膜蛋白的高通量筛选去垢剂的流程。

首先他们使用常用去垢剂DDM把蛋白提取出来，接下来将待筛选的去垢剂预装至96孔板中，把提取出来的蛋白直接进行稀释，孵育一小时后使用蛋白稳定性分析仪Promethus检测蛋白的Tm与Tagg值。根据检测到的数据，研究人员制作出热图，图中深绿色的条件代表目标膜蛋白在该去垢剂中Tm与Tagg值较高，状态接近于天然的构象，而红色则代表该去垢剂会使目标膜蛋白变性。

难题 2

使用脂质立方相(LCP)这一种类膜环境中结晶膜蛋白，由于LCP的粘稠性以及相行为，使用基于染料的DSF或DSC的方法来评估蛋白的稳定性基本是不可行的。

使用LCP的结晶方法需要筛选不同的脂质和添加物，把每个LCP组成条件放在许多不同的沉淀剂缓冲液中试验结晶。为了找到良好的LCP条件，最大限度地提高膜蛋白的稳定性，以减少不同结晶试验的次数，爱尔兰科学家使用Promethus蛋白稳定性分析仪进行了脂立方相中的膜蛋白稳定性检测，并建立了一套方法学，用来快速筛选膜蛋白介观结晶的LCP条件。

以膜蛋白LntEco为例，研究人员首先检测了它在9.9 MAG制备的LCP中的热变性曲线和聚集曲线，然后在脂立方相中进行了与结晶相关的多种处理，包括使用不同的脂质主体、附加脂质体和配体，再用nanoDSF技术检测得到其Tm值的变化，以反映出该种处理方法对LntEco的热稳定性的影响。这一系列的测试也证明了无标记的nanoDSF技术能够在非常粘稠的LCP中测量膜蛋白的稳定性，帮助研究人员在膜蛋白结晶试验之前筛选LCP的条件。

难题 3

在表征膜蛋白功能时，需要在类膜的环境中保持它的天然结构和功能

Nanodiscs可使膜蛋白处于类似磷脂双分子层的环境中，从而模拟膜蛋白在细胞膜中的构象和生物学功能；因此, Nanodiscs在膜蛋白领域的研究工作起到很大的作用。

2020年，德国工业大学的研究人员就利用了Nanodisc这一工具研究了甘氨酸受体 (GlyR) 在类膜环境中表现出的配体特异性的构象变化（图a），并通过NanoTemper公司的Monolith分子互作仪检测了GlyR与其激动剂的相互作用。

为了分析GlyR随着完全激动剂glycine的浓度改变而产生的构象变化，研究人员以Nanodisc溶解的His-GlyR纯化蛋白作为target，glycine作为ligand进行了MST实验，得到EC50= 65 ± 22.8 μM（图b），这与通过电生理学方法获得的表观EC50值相似。

接下来，研究人员以GlyR与不完全激动剂taurine的相互作用为研究对象，对比了完全和不完全激动剂所产生的MST信号差异。在这次实验中，研究人员使用卵母细胞表达GlyR-GFP蛋白，并以加入Nanodiscs的细胞裂解液溶作为target直接进行检测，无需纯化GlyR蛋白。结果显示GlyR与taurine 结合的EC50 = 473.8 ± 46.1 μM，亲和力小于Glycine，与预期一致（图c）。以此数据为基础，研究人员推导出由两种激动剂引起的GlyR构象变化模型。

这项研究揭示了GlyR由特定激动剂诱导的构象特征，和在自然环境中配体结合决定受体激活的机制。对于低丰度且难以纯化和固定的膜蛋白，Monolith分子互作检测仪可以实现免纯化检测，直接得到膜蛋白在细胞裂解液中与配体的亲和力，在保证膜蛋白处于天然环境中，最大程度维持其构象和功能的同时节省您制备样品的时间。

（图a）Nanodiscs中的GlyR 示意图

（图b） MST检测GlyR与Glycine 结合的亲和力

(图c) MST检测GlyR与与Glycine和Taurine结合的亲和力

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