植物互作研究中的难点和MST的解决方案

方案标题：植物互作研究中的难点和MST的解决方案

检测样品：植物组织

检测项目：植物蛋白和其他分子

应用领域： 生物

方案摘要：

在植物领域的互作研究中，可能会遇到各种困难：

1. 蛋白与小分子互作：植物信号通路研究中常涉及到膜蛋白与离子/激素类等小分子（1kD以下）的互作，分子量差异大，互作检测信噪比低；

2. 难纯化：植物蛋白原核表达后常处于包涵体内，较难提纯；转基因植物蛋白表达量低，难纯化，且植物自发荧光高；GFP融合表达蛋白，无法纯化；体外缓冲液条件下无互作

3. 竞争结合实验：传统的竞争结合实验（Pull Down，BiFC等）操作步骤繁琐，假阳性高，样品消耗量大，且无法定量分析结合同一个目标的两种或以上分子的亲和力；

4. 蛋白质和核酸互作：常规EMSA的检测方法步骤繁琐，且涉及到放射性同位素等有害物质，同时无法进准确定量；RNA易降解；

5. 样品准备周期长，处理繁复，样品珍贵且数量少。传统互作实验样品消耗量大

这些问题均可使用MST分子互作技术一一解决！

方案详情:

MST应用案例——蛋白质和小分子互作

植物免疫抑制与广谱抗病机理

Gao, Mingjun, et al. "Ca2+ sensor-mediated ROS scavenging suppresses rice immunity and is exploited by a fungal effector." Cell 184.21 (2021): 5391-5404

植物是如何平衡广谱抗病与生存代价的呢？中国科学院分子植物科学卓越创新中心何祖华研究团队研究发现以ROD1为免疫抑制中枢，集成Ca2+感知、ROS代谢和泛素化介导的蛋白质降解，调节免疫反应，平衡防御和生长之间的冲突。

图示：MST技术检测ROD1和Ca2+的的结合亲和力

绿色曲线代表Ca2+与ROD1的亲和力；蓝色/红色曲线代表Ca2+与天冬氨酸残基突变体ROD1D132N/ROD1D-quad的亲和力

ROD1蛋白易降解，且与Ca2+(40D)分子量相差悬殊，使用耗时较长或者基于分子量变化的互作技术无法实现亲和力的检测。作者采用微尺度热电泳(MST)方法，证实ROD1与 Ca2+具有μM级亲和力。将ROD1 C2结构域中负责与Ca2+结合的天冬氨酸残基(D)突变后，Ca2+结合活性大大降低。另外，遗传学等研究结果表明，Ca2+结合与ROD1定位相关，进而影响ROD1免疫和植物生长调节功能。

相关文献

1，Parker, Joanne L., and Simon Newstead. "Molecular basis of nitrate uptake by the plant nitrate transporter NRT1. 1." Nature 507.7490 (2014): 68-72.

2，Wang, Jizong, et al. "Allosteric receptor activation by the plant peptide hormone phytosulfokine." Nature 525.7568 (2015): 265-268.

MST应用案例——免纯化互作检测

高温胁迫下HSP21蛋白保护光合复合体的分子机制。

Chen, Si‐Ting, et al. "Identification of core subunits of photosystem II as action sites of HSP 21, which is activated by the GUN 5‐mediated retrograde pathway in Arabidopsis." The Plant Journal 89.6 (2017): 1106-1118.

前人研究发现位于叶绿体的热激蛋白21（HSP21）能够保护光系统复合体II (PSII)，使其免受热胁迫或者热胁迫引起的氧化胁迫，但其作用的分子机制尚不清楚。研究团队发现，热胁迫下拟南芥HSP21被依赖于GUN5的逆向信号通路激活，并直接结合光系统复合体PSII的核心亚基D1和D2蛋白来稳定光系统复合体。 组成性表达HSP21可以增强热胁迫下PSII 的热稳定性，修复  gun5 突变体的热敏感性，表明 HSP21 是热胁迫条件下维持类囊体膜系统完整性的关键伴侣蛋白。研究人员借助MST技术直接在接近天然状态下的裂解液中检测了HSP21蛋白与PS II核心亚基D1和D2蛋白之间的亲和力。

图注： MST技术检测HSP21和植物裂解液中D1/D2结合

植物蛋白尤其是膜蛋白较难纯化或者纯化后活性易受影响无法进行后续实验，利用MST技术，可直接在植物裂解液内进行亲和力检测，无需纯化。在本次实验中，作者直接使用过表达35S::D1-eYFP或35S::D2-eYFP的转基因植物组织裂解液，向其中加入梯度稀释的纯化HSP21蛋白，检测得到HSP21与D1/D2的亲和力Kd分别为0.67μM和1.32μM.

其他参考文献：

1，Shao, Wanchen, et al. "Microscale thermophoresis as a powerful tool for screening glycosyltransferases involved in cell wall biosynthesis." Plant methods 16.1 (2020): 1-12.

2, Khavrutskii, Lyuba, et al. "Protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis." Journal of visualized experiments: JoVE 78 (2013).

MST应用案例——竞争结合实验

植物亲和花粉信号转导机制

Liu, Chen, et al. "Pollen PCP-B peptides unlock a stigma peptide–receptor kinase gating mechanism for pollination." Science 372.6538 (2021): 171-175.《Science》（2021） IF：41.8

开花植物识别本物种花粉，而拒绝其他物种花粉的生殖隔离机制尚不清晰。华东师范大学研究发现，拟南芥成熟未授粉的柱头内ANJ-FER受体激酶复合物与柱头内的RALF33多肽结合，引起活性氧产生。而ANJ/FER受体激酶复合物与花粉中花粉外壳蛋白（PCP-Bs）互作，抑制ROS产生，使花粉水化。作者通过MST实验解析ANJ-FER复合物如何协调PCP-Bs和RALF33多肽来调节柱头中的ROS水平。

图示：通过MST技术分析PCP-Bγ多肽对RALF33和FERecd结合的抑制作用。

红色曲线：FERecd与FITC-RALF33的亲和力Kd为0.1604μM，

黄色曲线：加入PCP-Bγ，其对FERecd-RALF33结合的抑制常数Ki为0.5009μM

传统竞争结合方法实验步骤繁琐，且无法得到定量互作信息。作者利用MST技术完成了RALF33, FER/ANJ和PCP-Bγ三元复合体系中的竞争结合检测：将RALF33与FERecd孵育，使其达到结合平衡，然后加入梯度稀释的PCP-Bγ，检测得到Ki值为2.5099 μM，即PCP-Bγ与RALF33竞争结合FERecd/ANJecd，从而抑制RALF33诱导的柱头ROS的产生，加速了花粉水化。

1, Yang, Chao, et al. "Binding of the Magnaporthe oryzae chitinase MoChia1 by a rice tetratricopeptide repeat protein allows free chitin to trigger immune responses." The Plant Cell 31.1 (2019): 172-188.

2, Jin, Lian, et al. "Rice dwarf virus P2 protein hijacks auxin signaling by directly targeting the rice OsIAA10 protein, enhancing viral infection and disease development." PLoS pathogens 12.9 (2016): e1005847.

MST应用案例——蛋白质与核酸互作

水稻抗病毒免疫的分子机制  

Yang, Zhirui, et al. "Jasmonate signaling enhances RNA silencing and antiviral defense in rice." Cell Host & Microbe 28.1 (2020): 89-103.

高等植物通过小RNA介导的RNA沉默进行抗病毒，已有研究表明，病毒感染引起RNA沉默组件上调表达，而上调的机制是未知的。北京大学李毅团队研究发现水稻条纹病毒（RSV）外壳蛋白触发茉莉酸（JA）的积累，并上调JA应答转录因子（JAMYB）。JAMYB直接与RNA沉默核心组件Argonaute 18（AGO18）启动子结合，激活AGO18转录，进而提高水稻的抗病毒防御能力。作者通过MST技术确定了JAMYB在AGO18启动子上的顺式元件结合位点。

图示：（左）图解摘要；（右）MST技术分析JAMYB与AGO18启动子结合位置

蓝色曲线：JAMYB与AGO18启动子R3区域有结合，Kd=828 nM

黄色曲线：JAMYB与突变的R3区域无结合

红色曲线：突变的JAMYB与AGO18启动子R3区域无结合

黑色曲线：突变的JAMYB与突变的R3区域无结合

MST实验时，直接合成带有FAM的R3序列作为荧光信号源，加入梯度稀释的JAMYB。检测结果显示，JAMYB结合在AGO18启动子的R3区域有结合，通过突变R3，导致JAMYB无法特异性识别，进而确定了该位点对于AGO18转录调控的重要性。

其他参考文献：

1，Yao, Shengze, et al. "Transcriptional regulation of miR528 by OsSPL9 orchestrates antiviral response in rice." Molecular plant 12.8 (2019): 1114-1122.

2，Liu, Zhi‐Qin, et al. "A conserved double‐W box in the promoter of CaWRKY40 mediates autoregulation during response to pathogen attack and heat stress in pepper." Molecular plant pathology 22.1 (2021): 3-18.

 MST应用案例——节约样品和时间

植物调控花粉管细胞完整性与精细胞释放的分子机制

Ge, Zengxiang, et al. "Arabidopsis pollen tube integrity and sperm release are regulated by RALF-mediated signaling." Science 358.6370 (2017): 1596-1600.

被子植物受精过程中如何调控花粉管爆炸释放精子的机制尚不清晰。瞿礼嘉课题组的研究发现了拟南芥花粉管质膜上的两个受体BUPS1和BUPS2可与AXN1/2形成异源受体复合体，该复合体可与自身分泌的小肽分子RALF4/19结合，维持花粉管的完整性。而雌性来源的小肽分子RALF34可竞争性取代RALF4/19，从而导致花粉管的破裂，释放精子。研究团队使用MST技术，对RALF4/19分别与BUPS1/2和ANX1/2胞外域的结合亲和力进行测定。

图示：MST技术检测BUPS1/2、ANX1/2胞外域与RALF4/19/23之间的亲和力

作者对BUPS1/2和ANX1/2进行His-Tag荧光标记，分别检测与RALF4/19/23亲和力，共进行11组MST实验。每组Kd值检测仅需100nM的标记蛋白120μL，并在15min内完成，快速准确的验证了RALF4/19正是BUPS-ANX受体复合体的配体。

其他文献

1， Sloan, Jeremy, et al. "Structural basis for the complex DNA binding behavior of the plant stem cell regulator WUSCHEL." Nature communications 11.1 (2020): 1-16.

2，Shao, Wanchen, et al. "Microscale thermophoresis as a powerful tool for screening glycosyltransferases involved in cell wall biosynthesis." Plant methods 16.1 (2020): 1-12.

 MST应用案例——GFP融合蛋白作为荧光信号源

淹水胁迫下信号传递机制

Lehmann, Julian, et al. "Acidosis-induced activation of anion channel SLAH3 in the flooding-related stress response of Arabidopsis." Current Biology 31.16 (2021): 3575-3585

淹水胁迫导致厌氧菌引发的胞质酸中毒，使植物细胞感知酸性并通过膜去极化传递这种信号的分子机制尚不清晰。德国维尔茨堡大学研究表明，在拟南芥的根中，酸中毒诱导的阴离子流出依赖于阴离子通道AtSLAH3，细胞质子浓度的增加使SLAH3从二聚体形式转变为活性单体形式，激活了阴离子通道。研究发现硝酸盐对于pH依赖的通道激活至关重要，并通过MST技术研究SLAH3与NO3-的结合。

图示：（左）淹水相关胁迫响应中酸中毒诱导的阴离子通道SLAH3的激活

   （右）MST技术检测不同PH下SLAH3与NO3-亲和力。

作者表达SLAH3- GFP融合蛋白作为荧光信号源，无需其他标记。在pH6.5下检测到SLAH3与NO3-相互作用的Kd为120±50 mM。在pH为7.3时，SLAH3仍与NO3-结合，但亲和力降低了60%，表明SLAH3与阴离子的结合依赖于pH。

相关文献：

1， Oliveira Andrade, Maxuel, et al. "The MAF1 phosphoregulatory region controls MAF1 interaction with the RNA polymerase III C34 subunit and transcriptional repression in plants." Plant Cell 32.9 (2020): 3019-3035.

2， Liu, Hui, et al. "WRINKLED1 regulates BIOTIN ATTACHMENT DOMAIN-CONTAINING proteins that inhibit fatty acid synthesis." Plant physiology 181.1 (2019): 55-62.