MST分子互作技术在植物与病原菌互作研究中的应用

方案标题：MST分子互作技术在植物与病原菌互作研究中的应用

检测样品：植物蛋白

检测项目：植物蛋白和病原菌

应用领域： 生物

方案摘要：

植物在整个生命周期中会经受多种微生物病原的侵袭，包括真菌，细菌，病毒，线虫等，作物约30%的产量损失是由病原体造成的，病害是农业可持续发展面临的主要问题。在植物与病原数百万年的协同进化中，植物与病原的互作经历了很多阶段，为掌握植物与病原互作中的重要信号分子，深入了解植物免疫分子机制，不可避免的要进行分子间互作的检测，今天来看一下为微量热泳动（MicroScale Thermophoresis, MST）分子互作技术在植物抗病方面的应用吧！

方案详情:

植物与真菌---蛋白和离子

Gao, Mingjun, et al. "Ca2+ sensor-mediated ROS scavenging suppresses rice immunity and is exploited by a fungal effector." Cell 184.21 (2021): 5391-5404.

植物如何平衡抗病和生长发育平衡，中国科学院分子植物科学卓越创新中心何祖华团队研究揭示了以ROD1为免疫抑制中枢，通过降解超氧活性因子ROS，抑制植物的免疫反应，平衡植物防御和生长之间的冲突。

水稻中，ROD1编码一种Ca2+传感器蛋白，以Ca2+依赖的方式结合到磷酸肌醇脂质，靶向至特定膜区域。ROD1刺激过氧化氢酶CatB的活性，促进活性氧(ROS)清除，抑制免疫；当有稻瘟菌侵染时，植物通过降解ROD1减弱其功能，产生有效的防卫反应。作者使用MST技术检测ROD1可直接与Ca2+结合，并鉴定出活性结果位点。

图注：MST技术分析ROD1与Ca2+的亲和力和活性结合位点

另一方面，研究发现病原稻瘟菌中具有与ROD1结构类似的毒性蛋白AvrPiz-t，在植物体内盗用ROD1的免疫抑制途径，实现侵染的目的，进而与病原菌共同生存。通过MST检测到AvrPiz-t与Ca2+结合，进而盗用ROD1途径。

图注： MST技术比较ROD1和AvrPiz-t的Ca2+结合活性

植物和细菌---蛋白和蛋白（Dimmer）

Xu, Ning, et al. "A plant lectin receptor-like kinase phosphorylates the bacterial effector AvrPtoB to dampen its virulence in Arabidopsis." Molecular plant 13.10 (2020): 1499-1512.

质膜定位受体样激酶(RLKs)感知植物中保守的病原相关分子模式(PAMP)，触发免疫(PTI)。拟南芥凝集素受体激酶LecRK-IX已被证明调节细菌鞭毛蛋白来源肽flg22诱导的PTI。而许多病原体分泌的效应蛋白可抑制植物免疫。植物中是否存在某种机制抑制或削弱病菌分泌的效应蛋白的功能？

中科院微生物所刘俊研究组研究发现效应蛋白AvrPtoB是丁香假单胞菌的主要毒力效应子。AvrPtoB C端有一个功能的E3连接酶结构域，以植物中的鞭毛识别受体FLS2和几丁质识别受体CERK1为目标进行降解，导致PTI的抑制。本研究中，作者发现效应蛋白AvrPtoB与拟南芥凝集素受体激酶LecRK-IX.2相互作用并泛素化降解LecRK-IX.2，抑制其介导的免疫。AvrPtoB在体外和体内都能形成二聚体，这种二聚体形成对其E3连接酶与底物的结合和泛素化所必需的。然而, LecRK-IX.2能与AvrPtoB S335位点互作并使其磷酸化，S335的磷酸化破坏AvrPtoB二聚体状态，导致其抑制PTI反应的毒力下降。作者的研究表明，宿主RLKs可以修饰病原体效应器，以抑制其毒性，并削弱其抑制PTI的能力。

图示：AvrPtoB对LecRK-IX.2的泛素化与其被磷酸化竞争模式图

为了检测AvrPtoB与自身以及与LecRK-IX.2亲和力大小，作者进行MST实验。结果表明，AvrPtoB与LecRK-IX.2的亲和力（0.02μM）要远高于其自身形成二聚体的亲和力（18.7μM）,表明AvrPtoB更容易与LecRK-IX.2结合。

图注：MST技术检测AvrPtoB自身以及与LecRK-IX.2CD

植物与病毒——蛋白与离子/核酸/蛋白

Yao, Shengze, et al. "The key micronutrient copper orchestrates broad-spectrum virus resistance in rice." Science Advances 8.26 (2022): eabm0660.

铜是植物生长发育的重要调节剂，然而铜对病毒入侵的反应机制尚不清楚。之前的研究表明，SPL9介导的miR528转录激活为已建立的AGO18- miR528 - L- AO抗病毒防御增加了一个调控层。北京大学李毅课题组研究发现，Cu2+通过抑制SPL9的蛋白水平来抑制miR528的转录激活，进而提高ROS水平，增强AO积累量及其酶活，从而加强抗病毒反应，阐明了铜稳态的分子机制、调控网络以及SPL9-miR528-AO抗病毒途径。

为了检测SPL9和Cu2+之间的直接相互作用，作者纯化了SPL9 DNA结合区域（SPL9 SBP），使用Monolith分子互作仪检测其与Cu2+的互作。结果显示SPL9 SBP直接与Cu2+结合，但不与Ca2+结合。

图注：Monolith检测SPL9与Cu2+亲和力

此外，李毅课题组在2020年研究结果解析了植物体内抗病毒RNAi信号通路，同样用到了MST技术。

Yang, Zhirui, et al. "Jasmonate signaling enhances RNA silencing and antiviral defense in rice." Cell Host & Microbe 28.1 (2020): 89-103.

水稻抗病毒RNAi信号通路的核心蛋白AGO18受病毒侵染诱导，进而增强水稻的抗病毒免疫；但是病毒侵染如何诱导水稻AGO18的了解很少。北京大学李毅课题发现病毒外壳蛋白（CP）过表达能够诱导水稻茉莉酸（JA）的显著积累，JA信号通路的关键转录因子（JAMYB）能够结合并激活AGO18的启动子，从而诱导AGO18的表达，抑制病毒的侵染。

为了分析AGO18启动子上的顺式作用元件，作者进行了MST实验。将顺式作用元件带上FAM荧光，作为荧光信号源，检测到JAMYB结合在AGO18启动子上的顺式作用元件R3，R3突变后AGO18和JAMYB丧失结合能力，进而确定了该位点对于AGO18转录调控的重要性。

图3. MST检测的JAMYB和AGO18 R3区域的结合（蓝色曲线）

此外，作者通过MST实验发现，水稻JAZ6蛋白能够通过与JAMYB相互作用来抑制其转录激活活性，表明JAZ6抑制水稻抗病毒RNA沉默并损害水稻抗病毒免疫反应。

图2. MST检测的JAMYB和JAZ6的结合

该研究揭示了植物JA信号通路与RNAi信号通路协同参与水稻抗病毒防御的分子机制。

植物与线虫—蛋白和多肽

Zhang, Xin, et al. "Nematode-encoded RALF peptide mimics facilitate parasitism of plants through the FERONIA receptor kinase." Molecular plant 13.10 (2020): 1434-1454.

植物寄生线虫是全球性的粮食作物病虫害之一，然而线虫与宿主植物相互作用的机理仍尚不清楚。植物细胞膜上的受体蛋白FERONIA及其配体RALFs参与调节植物免疫反应。湖南大学和中国农科院植物保护研究所联合解析研究发现FERONIA突变导致植物对RKN表现出低敏感性。另外，作者在6类根结线虫中鉴定了18种RALF-like基因，编码的小肽可以直接结合到FERONIA的胞外结构域，从而“挟持”植物FER信号途径，破坏植物免疫系统，促进寄生。

研究时，为了检测了线虫RALF- like小肽 MiRALF1/3是否同拟南芥At-RALF1具有相似的FER结合模式,作者使用MST进行检测。结果显示MiRALF1/3与FERECD亲和力分别是25μM和64μM，而AtRALF1亲和力略高，Kd为1.7μM，证明了线虫RALF -like具有植物RALF的典型活性，且可以结合FER。

图注：MST检测FERECD与AtRALF1、MiRALF1或MiRALF3之间的亲和力

在病原物和植物的识别到特定的防卫反应过程中，二者通过互作进行信号的传导，通过MST技术检测明确二者互作过程中的识别，免疫激发，通路调控和协同进化的详细机制，更好的分析和比较分子间作用和通路的调控。无论是植物和各种病原物的组织来源，均可在MST上完成检测，助力植物病理科学家们更好的解析植物和病原物的互作和协同进化。