IF: 46.9 | 多元互作案例分享--首选NanoTemper的MST技术！

蛋白质在发挥生物学功能时，常常需要与其他分子发生结合形成复合物。相比于研究单体蛋白质，直接研究蛋白复合物的功能以及与其他分子的互作能更加清楚的解释生物学问题或者开发真正发挥作用的药物分子。

复合物一般分子量更大，互作检测时需保证复合物处于正确的结合构象，而其他基于固定相技术可能会影响复合物的构象，或无法与待检测互作分子达到平衡，影响检测结果。这次我们带来的这篇文献，讲述如何使用MST技术成功检测DNA-蛋白复合体与ssDNA互作的故事。

https://doi.org/10.1038/s41587-024-02255-7IF: 46.9 Q1

V型和VI型CRISPR-Cas系统已被证明可以在crRNA引导下切割靶标DNA/RNA（顺式切割）。此外，还可以随机切割非特异性单链DNA/RNA（反式切割），但在II型CRISPR-Cas系统中尚未观察到反式切割。

2024年5月29日，厦门大学生命科学学院刘亮教授课题组发表在Nature biotechnology (IF:46.9)上，题为“Trans-nuclease activity of Cas9 activated by DNA or RNA target binding”的研究论文，首次揭示了gRNA (guide RNA)引导的Cas9对ssDNA和ssRNA底物都显示出RuvC结构域依赖的反式切割活性。同时，通过MST技术研究Cas9-sgRNA-target RNA复合物对反式切割底物的序列偏好。基于Cas9的反式切割活性和核酸扩增技术，作者开发了DNA/RNA激活Cas9的核酸检测平台。

通过分析Cas9-sgRNA-target RNA复合物的结构信息发现，Cas9与dgRNA和互作ssDNA组装后，Cas9的两个催化结构域参与形成了一个能够容纳非靶DNA的通道。作者怀疑该通道上可能会结合一个序列和结构特异性的DNA底物。接下来，需检测SpyCas9 - sgRNA -target ssDNA复合物是否可直接结合非特异性poly ssDNA底物以及对底物的偏好性。

由于MST是一种在溶液条件下进行直接检测互作亲和力的手段，无需对样品进行固定，因此，不会因固定对SpyCas9 - sgRNA -target ssDNA复合物结构造成影响。此外，MST检测两个分子达到结合解离平衡状态，因此，对于涉及到的非常复杂的复合物SpyCas9 - sgRNA -target ssDNA和另外ssDNA的互作检测，MST也可轻松供应对。实验时，将cy5荧光标记的crRNA -target ssDNA(TS)与SpyCas9-sgRNA 提前孵育形成稳定的复合物，再加入ssDNA，孵育平衡后进行亲和力检测，获得更加准确的亲和力K_d结果。MST结果表明，SpyCas9偏好poly(T)和poly(C)。

图示：MST检测SpyCas9-sgRNA-TS复合物与poly(A)、poly(T)、poly(C)和poly(G)之间的相互作用

在这篇文献中，通过MST技术检测复合物SpyCas9-sgRNA-TS复合物与底物ssDNA的相互作用。对于分子互作亲和力的检测，Monolith系列仪器不依赖于分子量的改变，蛋白用量少，可以在溶液中表征蛋白复合物和其他分子的相互作用，有利于多元分子平衡，获得更加准确的亲和力结果。

Monolith分子互作检测仪