文献解读 | NanoTemper助力结核分枝杆菌细胞壁通路靶标膜蛋白研究

膜蛋白生命活动中具有重要作用，也是重要的药物靶点，而膜蛋白在进行互作研究过程中会有许多难点：

1.    膜蛋白一般需要去垢剂来模拟脂质生物环境。对于基于固定的互作技术，去垢剂会增加背景信号，或者存在参比通道和样品通道背景不同的可能。

2.    膜蛋白结构复杂，且与配体结合后可能发生变构。因此研究互作时，膜蛋白的正确构象至关重要。基于固定的技术可能阻碍变构过程，或者在固定和再生过程中破坏膜蛋白的构象。

3.    膜蛋白的表达量低、纯化难，因此需要消耗量少的方法进行检测。

本期文献解读，讲述如何利用MST及nanoDSF的手段来进行膜蛋白互作研究的故事。

2024年3月15日，上海科技大学张璐研究员/饶子和院士团队在Nature Microbiology发表题为“Structural analysis of phosphoribosyltransferase-mediated cell wall precursor synthesis in Mycobacterium tuberculosis”的研究，解析结核分枝杆菌全新药物靶标——膜蛋白磷酸核糖转移酶Rv3806c与其受体底物DP和供体底物PRPP结合复合物的精细三维结构，为研究Rv3806c作为新靶点的靶向性药物研发提供了重要的理论基础。

https://doi.org/10.1038/s41564-024-01643-8IF: 28.3 Q1

通过对Rv3806c与供体底物PRPP复合物结构分析，推测可能影响Rv3806c结合和酶活的位点，并通过MST进行大量突变Rv3806c亲和力检测进行验证。

Rv3806c为膜蛋白，并且在脂质环境中以三聚体形式组装。实验种共有10种突变体需进行K_d检测，每次实验均进行了5次重复。

MST进行一次亲和力检测时，仅需32pmol、1μg的膜蛋白Rv3806c，大大节约蛋白消耗量。此外，MST技术是在溶液条件下进行，无需固定，且兼容去垢剂，使膜蛋白能保持正确的构象，甚至可以完成nanodisc或者膜提取物形式的膜蛋白亲和力检测，从而可以轻松表征膜蛋白Rv3806c多种突变体与底物PRPP的亲和力。

图示：MST测定PRPP与WT-Rv3806c及突变体的结合亲和力

此外，研究发现，供体底物PRPP通过一个Mg²⁺结合在TM螺旋束-1的空腔。为了研究Mg²⁺对Rv3806c结合供体底物PRPP的作用，作者使用MST和nanoDSF技术检测存在或不存在Mg²⁺时，Rv3806c与底物PRPP的结合。

NanoDSF技术通过监测蛋白内源荧光的变化来表征蛋白结构，无需加入外源荧光染料，兼容去垢剂。使用GDN纯化的Rv3806c完成MST亲和力实验和nanoDSF的热迁移实验，结果显示Mg²⁺对于PRPP的结合至关重要。

图示：MST分析在Mg²⁺存在或不存在的情况下，PRPP与Rv3806c的结合亲和力。在没有Mg²⁺的情况下，结合亲和力急剧下降，而在金属螯合剂EDTA的存在下，没有检测到结合。

图示：在Mg²⁺、PRPP和EDTA存在或不存在的情况下，纯化后的Rv3806c的nanoDSF热稳定性分析。PRPP-Mg²⁺存在时Rv3806c表现出最高的热稳定性。

在这篇工作中，通过MST技术及nanoDSF技术，确定了膜蛋白Rv3806c与PRPP结合的关键残基，以及Mg²⁺在互作过程中的关键作用。对于分子互作亲和力的检测，Monolith系列仪器无需固定样品，且不限制缓冲条件，蛋白用量少，可以在溶液中表征膜蛋白与小分子的亲和力。

Promethus系列仪器，以nanoDSF技术为核心，通过检测蛋白内源荧光监测蛋白的稳定性，无需外源荧光染料，兼容去垢剂，低浓度也可轻松表征，在膜蛋白稳定性分析和TSA互作定性研究上具有显著优势。

-Monolith分子互作检测仪-

-PR Panta蛋白稳定性分析仪-