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免纯化亲和力检测 | Monolith 助力膀胱癌发生发展机制研究

NanoTemper

2023/12/14 11:59

阅读:93

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研究背景

膀胱癌(BLCA)是公认的泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,约占前列腺癌的10%。全世界每年有57万新bing例和21万例死亡。由于其复发倾向和持续监测和随访的必要性,它是经济负担最高的癌症之一。因此,探讨膀胱癌发生发展的机制,寻找诊断和治疗方法是十分必要的。

研究内容

武汉大学中南医院、武汉大学医学研究院王行环团队此前的研究显示POLD1是膀胱癌恶性转变过程中的一个关键分子。在此基础上,王行环团队证实POLD1在膀胱癌组织中较癌旁组织高表达,在肌层浸润性膀胱癌中较非肌层浸润性膀胱癌高表达,且与预后相关。团队在体内和体外实验中证明了POLD1能够促进膀胱癌的增殖和转移。进一步进行机制研究发现,POLD1通过与FBXW7竞争性结合MYC,从而减弱FBXW7介导的MYC泛素化降解。此外,机制研究还发现POLD1可以与MYC形成复合物参与MYC的转录调控,增强MYC的转录活性;另一方面,MYC能够转录激活POLD1,从而形成了一个POLD1-MYC正反馈回路,增强了对膀胱癌的促癌作用(图1)。这项研究成果于2023年发表在 Nature Communications 杂志。

https://doi.org/10.1038/s41467-023-38160-xIF: 16.6 Q1


研究人员首先通过CO-IP验证了POLD1与MYC的结合,而当去掉MYC中与FBXW7α结合的区域MB1后,就检测不到结合了。


所以研究团队合成了MB1肽段,然后用NanoTemper公司的Monolith分子互作技术检测了POLD1与MB1肽之间的亲和力,并与 FBXW7α作对比,证明POLD1对MB1的亲和力比FBXW7α强,因此它可以与FBXW7α竞争结合MYC(图2)。在这个实验中,POLD1和FBXW7α 也都是与GFP融合表达在293T细胞,直接使用细胞裂解液作为target进行检测,无需纯化蛋白。


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图1:POLD1通过稳定MYC调节BLCA的增殖和转移,促进膀胱癌发生发展

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图2:MST技术检测293T细胞中过表达GFP-POLD1的裂解物与MYC-MB1 (WT)肽的结合亲和力


技术优势

Monolith系列仪器在检测分子间相互作用时,可以直接检测细胞裂解液中的靶标蛋白于配体的亲和力,无需纯化蛋白。这种方法特别适合检测难纯化,或纯化后不稳定的蛋白样品,为科研人员节省蛋白纯化的时间,减少工作量。

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