2022/02/23 17:10
阅读:197
分享:方案摘要:
产品配置单:
Naica 6通道微滴数字PCR系统
型号: STILLA Naica
产地: 法国
品牌: STILLA
面议
参考报价
联系电话
Naica高通量微滴芯片式数字PCR系统
型号: Naica HT
产地: 法国
品牌: STILLA
面议
参考报价
联系电话
方案详情:
基因编辑脱靶检测丨德国汉堡大学科学家开发基于单细胞的CRISPR基因编辑低频脱靶事件新方法
CRISPR-Cas9技术彻底改变了基础生物研究和应用生物技术的许多领域。但在临床基因治疗实施中脱靶效应的检测仍然存在难题。德国汉堡大学-艾本多夫医学中心(UKE)干细胞移植、细胞和基因治疗研究所的学者们近日在知名杂志《Molecular Therapy》上发表“LATE–a novel sensitive cell-based assay for the study of CRISPR/Cas9-related long-term adverse treatment effects”的文章,建立了称为LATE(长期不良治疗效果鉴定检测)的新型检测方法,该方法使用Stilla naica®微滴芯片数字PCR系统检测低频的脱靶事件,且有助于分析Cas9脱靶切割效应的影响,并可在单细胞层面进行评估。
为了证明LATE方法有助于检测Cas9脱靶切割后的功能影响,研究人员进行了小规模的原理验证实验:明星基因TP53基因敲除后会导致细胞表现出相对生长优势,这是主要的致瘤性标志之一,因此可以作为验证“LATE”检测脱靶能力的指示。本文选取TP53进行CRISPR靶向实验,并转染到有限稀释后的原代人类新生儿包皮成纤维NUFF细胞中,通过“LATE”方法重复检测到低频(<0.5%)生长促进事件,这一结果证明了即使在低起始细胞数的情况下,LATE检测也具有高灵敏度,并且可以对单个细胞进行评估。
图 1. LATE检测原理
LATE检测的原理包括 (1)用编码荧光蛋白、设计的核酸酶(Cas9)和gRNA的慢病毒载体转导原代人类新生儿包皮成纤维细胞 (NUFF),(2) 使用流式细胞术分析转导率并连续监控长达10周,(3)读取结果,随着转导细胞数量的增加,作为基因组编辑效应的细胞获得生长优势
在这一过程中,“LATE”读取到的阳性结果(获得生长优势的细胞)会不会由TP53以外的基因被“脱靶敲除”引起,或者是序列存在其他的突变,例如插入诱变从而导致细胞获得生长优势呢?为了研究“LATE”检测的阳性结果与TP53插入缺失之间的联系,研究人员设计了GEF-dPCR(gene-editing frequency digital PCR)实验,即Drop-Off分析方法,该方法可以量化gRNA结合位点以及脱靶位点的插入缺失频率。
若想了解更多关于Drop-Off的检测方法,请复制下方链接:https://www.stillatechnologies.com/drop-off-crystal-dpcr-nras-kras-egfr-mutations/
图2. NUFF细胞获得的生长优势与TP53中的插入/缺失频率相关 (A)TP53外显子4片段和GEF-dPCR中使用的FAM、HEX标记探针的示意图。(B) TP53插入/缺失频率,数据由GFR-dPCR测量获得。(C) 脱靶TP53插入/缺失频率,由GEF-dPCR测量获得。
对于TP53 gRNA结合位点的检测,GEF-dPCR使用两个双标记水解探针,一个HEX标记探针与远离gRNA识别序列的区域结合,易发生插入缺失的位点设计FAM标记的探针(图2A)。
文中使用Stilla naica®微滴芯片数字PCR系统进行GFR-dPCR方法检测,实验方法详见原文第12页。
随后进行Stilla naica®微滴芯片数字PCR系统检测,结果显示随着时间的推移,TP53插入缺失的频率随之增加,转导后第7天插入缺失率为1%–22%,在52天后达到44%–85%的峰值,该变化趋势和细胞获得生长优势的趋势一致。(图2B)
研究人员还对TP53脱靶位点的插入缺失频率进行了检测(图2C)。上述dPCR检测结果也与NGS测序方法和RGB荧光标记方法一致,从而说明“LATE”能够检测TP53介导的gRNA的不良脱靶效应,但这些gRNA并没有被常用的在线预测工具标记为“危险信号”。
随后,作者还验证了“LATE”可用于任何类型的设计核酸酶以及不同的CRISPR/Cas变体,并且可以扩展用于其他细胞类型,尤其是高度相关的原代hMSC。因此,“LATE”实验方案可用于验证特定细胞类型中特定设计核酸酶的脱靶效应的影响。
图3:LATE检测可应用于hMSCs和h-TERT永生化细胞
综上,“LATE”可以作为一种简单、快速和经济的技术手段,用来评估CRISPR/Cas系统带来的生理“副作用”影响,辅助临床前的安全性研究,是对基于NGS的全基因组脱靶检测方法的有效补充,特别是补充了流式和数字PCR的检测结果。
原文:https://doi.org/10.1016/j.omtm.2021.07.004
期刊介绍:《Molecular Therapy》是美国基因治疗学会(ASGT)的月刊,是基因转导、载体开发与设计、干细胞制造、基因、肽、蛋白、寡核苷酸的开发、细胞疗法、疫苗开发、临床前目标验证、安全性/有效性研究和临床试验等领域的领先期刊。《Molecular Therapy》致力于促进遗传学、医学和生物技术的科学发展,影响因子为6.698。
下载本篇解决方案:
更多
qPCR技术在动物育种中的应用
盘古实时荧光定量PCR系统是基于高质量元件和高效的设计,结合智能、多功能分析软件,为动物育种科学研究提供高精准度、高灵敏度和高可靠性的实验结果。
农/林/牧/渔
2024/04/12
动物健康,盘古 Super 8全力守护
开展动物疫病检测,有利于及时明确动物病因及根源所在,降低疫病发生率,提高治疗效果,促进养殖业可持续发展。可以对动物疫病起到预防作用,真正准确分析当前动物疫病的流行特征及其可能对周边造成的危害。提高动物产品质量,使人们的食品安全得到尽可能的保障。 盘古 Super 8,全球首款使用通用耗材20min可得到结果,以它的快速、便携、简单、免校准和多机连用等优点全方位助力动物疫病检测。
农/林/牧/渔
2023/07/31
动物疫病早知道,盘古速8解烦恼
检测不及时?发现的时候已经开始死亡?动物死亡率高?你是否还在为动物疫病造成的经济损失而苦恼。究其原因是我们没有及时发现问题,提前采取措施。对动物疫病的检测,艾普拜公司提供全流程解决方案,从快速核酸提取到出检测结果,一站式解决,最快20分钟完成诊断,直接用药,极大的缩短了窗口期,及时用药治疗,减少死亡。
农/林/牧/渔
2023/07/10