观察者---显微镜下的空间与时间

从古至今，人类一直在追寻更高更远的真相，从远洋航行到太空探索，人们不断征服一个个宏伟的目标，但是人们肉眼所见的宏观世界不是世界的全部，还有人眼无法看清的微观世界，它同样也吸引着无数人去探索和追寻。

无论宏观还是微观事物，我们的观测都是基于三维空间的属性，即XYZ三维，而对事物形态变化的观察则需要再引入一个衡量因素--时间T，因此对事物观察的最完备方式一定是XYZT的同时记录，即形态+时间的长时间摄影，这也是显微镜的终极功能。

经过三百多年的发展，现代显微镜提出分辨率、景深、视野等概念，并不断提出解决方案，显微镜已经初步满足我们对微观世界观察的需求，帮助我们记录下微观世界的空间和时间。

微观世界观察最重要的是细节的分辨，分辨率的概念便由此诞生，分辨率是指人眼可以区分的两个点之间的最小距离，只在XY维度有效，根据瑞利判据，Rayleigh Criterion，正常人能分辨的极限是明视距离25cm处0.2mm的两个点，当我们使用显微镜后，我们可以看清更小距离的两个点，这便提升了我们观察的分辨率。随着现代研究的不断深入，人们对分辨率的要求也在不断提高，而科学家们也在不断的提升显微镜的分辨率，如电子显微镜将分辨率提升至纳米级别，实现了对病毒的观察，超高显微成像技术，将显微镜的分辨率从200纳米提升到几十纳米，实现了对活细胞细胞器的观察。

分辨率的提升也带来了新的问题，即视野和景深的减小，当用普通中央照明法（使光线均匀地透过标本的明视照明法）时，显微镜的分辨距离为d=0.61λ/NA，可见光波长范围为400—700nm，取其平均波长550nm，波长是固定常量，因此，增大NA数值，即可得到更小的D值，也就是可以分辨的两点之间的距离更小，可以让人眼看清楚更小的物体。

NA值即数值孔径，描述了透镜收光锥角的大小，NA = n * sinα，即透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（2α）半数的正弦之乘积。n为物镜与样本之间介质的光折射率，当显微镜物方介质为空气时，折射率n = 1 , 采用折射率高于空气的介质，可以显著提高NA值，水浸介质是蒸馏水，折射率为1.33；油浸物镜介质是香柏油或其它透明油，其折射率一般在1.52左右，接近透镜和载玻片的折射率，因此，油镜的NA值高于空气镜。

孔径角又称“镜口角”，是透镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度，增大镜口角，可以提高正弦值，其实际上限约为72度（正弦值为0.95），乘以香柏油折射率1.52，可以得出最大NA值为1.45左右，代入分辨率计算公式，可以得出常规显微镜极限XY平面分辨率为0.2um左右。

NA值还会直接影响显微镜的视野亮度（B）。由公式B∝N.A.²/ M² 我们可以推出，亮度随数值孔径（N.A.）的增大或者物镜倍率（M）的降低而增加。

从理论上来说，我们应该追求尽可能高的NA值，以获得更好的XY平面分辨率和视野亮度。然而凡事都有两面性，XY平面分辨率的提升，会带来Z轴景深和观察视野的减小。

显微镜一般都是垂直向下取景的，通过视场直径内观察到的物体表面凸起的位置与凹下的位置都能够看的很清楚时，那么凸点与凹点之间的高度差就是景深了，对于显微镜来说景深越大越好，景深越大在观察高低不平整的物体表面时，能够得到更好更立体的清晰度画面，大景深有助于我们对微观世界进行垂直方向形态的观察，也就是XYZ三维形态中的Z轴信息。

景深就是象平面上清晰的象所对应物平面的前后空间的深度：d_tot=(λ*n)/NA + n/(M∗NA) * e，d_tot：景深，NA ：数值孔径，M ：总放大率，λ：光波波长, （通常λ=0.55um），n: 试样与物镜之间介质的折射率（空气: n=1、油: n=1.52）根据这个公式，我们可以知道，Z轴景深与XY平面NA值成反比。

除了景深外，视野也受到NA值的影响，通过仪器固定注视一点时所能看见的空间范围即视野，它的计算与物镜的放大倍数直接相关，观察所看到的实际视野直径等于视场直径除以物镜的放大倍数，目镜会表明对应视场数，如10/18，即放大倍数10倍，视场直径18mm，因此当目镜确定后，放大倍数越大则观察的视野越小。

XY平面分辨率是对局部细节的解析，而视野则决定了我们对样本的观察范围，视野必然是越大越好，但受限于当前的技术，我们必须采用高倍物镜，才可以得到良好的NA值，因此,视野和NA值有间接的负相关系。

当我们需要观察的样本大于我们的视野时，每次观察只能看到一个局部，为了解决这个问题，拼图技术便应运而生。通过在XY方向移动样本，连续拍下不同位置的图像，最后拼接在一起，就可以得到一张全视野的图像。

▲镜下局部视野

▲拼接后全视野

▲手动拼接

▲自动拼接(图源：Echo显微镜)

拼接分为手动和自动两种，手动拼图成本低廉，但是对人员的操作水平，经验要求很高，如上图，操作人员稍有不慎，就会出现图片接缝问题，同时手动拼图速度慢，不适合大批量，高通量样本处理，比如医院病理科日均上百病理切片观察，手动拼图方式无法满足要求。

自动拼图的核心部件是全自动载物台，结合软件，可自动实现全自动，大范围全视野拍摄，结合自动Z轴对焦补偿，即可得到全视野的清晰图像。

Echo Revolution 全自动荧光显微镜

Echo Revolution全自动荧光显微镜，将XYZ三轴全部实现电动化，从而实现自动完成多图拼接的大视野高分辨率成像，而电动化的Z轴可以帮助用户实现自动聚焦、自动定焦和Z-Stacking 多层扫描大景深成像。Echo Revolution全自动荧光显微镜还添加了延时摄影功能，可以帮助用户实现长时间观察和时间回溯，使用户可以进行更全面的观察实验。