qPCR实验中如何科学取材

规划一个qPCR实验时，最先碰到的问题就是研究目的和材料的选择。要想做好一个qPCR实验首先要根据目的选好材料。

以目标为导向的取材

研究目标的设立是非常重要的一个起始环节，所以对于样本取材要求做到两点，具体准确性和具体代表性。

空间异质性

个体的生物变异程度（也可以解读为生物多样性）往往是比较高的，这也正是以群体细胞为研究对象的数据往往遭受质疑，而单细胞水平的研究正开展得如火如荼的原因。

如何使取到的样本更具代表性？

首先，提前做好功课，了解样本的不同分型，或者了解详细的细胞分群。如果条件允许尽可能覆盖所有的组织类型或者细胞类型。

其次，尽可能增加样本数量，也就是生物学重复，从而更客观地反映生物变异程度。一般建议生物学重复的数量至少是10。

时间异质性

生物个体的活动会受到生物节律的调控，细胞的转录水平也同样如此。由于转录的时间异质性，很多时候会导致qPCR的假阴性结果，如果采样时间不合适，会导致基因有表达或者表达量很低的错误结论。因此采样时首先要确认采样时间是否会对最后的结果造成影响，建议做一个比较全面的时间节点研究。

样本数量

前面建议增加生物学重复，但有时候超过10个的样本数量并不能保证最后能得到有显著表达量差异的结果（假如表达有显著差异是真实存在的），不到10个的样本数量在表达量差异很大的情况下也是足够的，这涉及到统计中的power calculation，很多网站提供在线计算，如http://www.univie.ac.at/ medstat等。Power calculation需要提供被比较的两个组表达量比值、标准差和设定的α和β水平，这样就可以计算出所需要的最少的样本数量。表达量比值和标准差等信息往往不能提前预知，需要查阅之前相似实验的数据，或者通过小规模的实验来获得粗略的信息。一般也可通过估算来得到所需的样本数量，提供一定的参考意义。

* power一定的情况检测不同表达量差异所需的最少样本数量[3].

采样是需要严格规划的过程，比如材料的时效性、珍贵程度等，都要纳入考量范围。本文讨论的几个因素对qPCR结果的影响是更直接的，需要倍加关注。

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