导读
Ct值是荧光定量PCR重要的结果呈现形式,它被用于计算基因表达量差异或者基因拷贝数。那么荧光定量的Ct值多大被认为是合理?如何保证Ct值的有效范围呢?
Ct值以及Ct值的作用:
Ct值概念:
也称循环阈值,C代表Cycle,t代表threshold。其含义是:在PCR 循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
Ct值的作用:
1)Ct值的重现性,PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。
注:模板为105k拷贝GAPDH,用GAPDH引物扩增。96个孔重复结果的Ct平均值为19.1,变异系数(Cv)=0.002.
2)Ct值与起始模板的线性关系,由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用标准曲线定量的方法。
注:样本进行10倍的倍比稀释后进行荧光定量检测得到的Ct值。
合理的Ct值范围:
Ct值的范围为15-35,Ct值小于15,认为扩增在基线期范围内,未达到荧光阈值。理想情况下,Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系,也就是标准曲线。通过标准曲线,扩增效率为100%时,计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右,若大于35,理论上模板起始拷贝数小于1,可认为无意义。
对于不同的基因Ct范围,因起始模板量中基因拷贝数和扩增效率不同,需做出该基因的标准曲线,计算出基因的线性检测范围。
影响Ct值的因素及解决办法:
由扩增循环数和产物量之间的关系:扩增产物量=起始模板量×(1+En)循环个数,可以看出,在理想条件下,起始模板量和En(扩增效率)会对Ct值产生影响。模板质量或者扩增效率的差异会造成Ct值偏大或过小。
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