上一篇文章跟大家介绍了qPCR实验中引物设计及加样的相关操作技巧,今天我们再跟大家分享其他的实用技巧,这些入门级知识一定要掌握牢固哦。
1、阴性对照的技巧:
阴性对照一般是指用水代替模板的反应孔,体系中除了模板,包括了其他的反应组分。由于qPCR的高灵敏性,阴性对照有出现扩增信号的情况,那么在针对这类问题时,我们需要判断其原因所在。
使用染料法进行qPCR实验时,首先查看阴性对照的溶解曲线主峰是否跟阳性孔的主峰位置一致。如果一致,要看两者Cq相差多少,比如,针对某一种引物的实验样品Cq值为28. 5,阴性对照的Cq值为33. 6,由于Cq值相差大于5,如果按95%的扩增效率计算,两者模板量相差28倍之多,对分析数据影响不大,所以实验样品的Cq值还是可以采用的;但是,如果两者的Cq值仅相差 1~2,这说明阴性对照中有较大的模板污染,则需要考虑更换试剂或引物,分区加样,重新实验。如果不一致,阴性对照主峰对应的Tm值小于阳性孔的Tm值,则可能是引物性能不好,无模板或使用低浓度模板下会出现引物二聚体,这种情况则需要考虑更换引物,保证引物特异性以及扩增效率。
▲ 图1:溶解曲线主峰位置基本一致时,S3是实验样品,NTC是阴性对照,
两者Cq相差大于5,实验样品的Cq值还是可以采用的。
▲ 图2:溶解曲线主峰位置不一致时,STD-1是高浓度样品,STD-5是中浓度样品,
STD-8是低浓度样品,NTC是阴性对照。随着模板浓度降低逐渐出现引物二聚体,导致扩增效率不准确。
使用TaqMan探针法进行qPCR实验时,由于探针法的高特异性,如果阴性对照出现扩增信号,很大可能是模板污染或气溶胶污染导致,操作时注意分区加样,避免污染。
2、结果分析的技巧:
进行相对定量分析时,最常用到的是 2-ΔΔCq法,但是这种方法比较粗放,因为它的前提是假定所有引物的扩增效率都为100%。更为准确的定量则需要考虑不同引物扩增效率的差别。可首先用梯度稀释的模板测试各引物的扩增效率E,获得实际扩增效率之后,后续实验只需要在软件中直接输入扩增效率E值,即可计算更精准的相对定量值。
在Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统中可在分析界面输入扩增效率E值,完成更精准的相对定量值的计算,如图所示:
Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统
Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统来自于美国Azure Biosystems公司,配备高品质温度模块,采用光纤和CMOS的检测系统,高能LED的激发,提供高灵敏和可靠的数据。
▲ Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统
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