MIQE中核酸质量控制环节怎么做，看完就懂。

RNA样本：

比较不同的样本时，应保证各样本中含有大致相同量的RNA，因此需要对所提取的RNA进行定量。常用的定量方法包括：分光光度法、荧光染料检测、琼脂糖凝胶电泳、毛细管凝胶电泳和3'：5'分析。

由于不同的方法产生不同的结果，因此直接比较不同方法的测定结果是很不科学的。建议使用荧光RNA结合染料(如RiboGreen)定量RNA，此法在检测低浓度目标时表现出最佳性能。任何情况下都建议仅使用单一方法测定所有样本并报告相关信息。检测和报告全基因组DNA的污染程度，并记录能够耐受的这些污染的临界值标准也是非常重要的。另外还应重点报告RNA样品是否已经过RNA酶处理(包括酶的类型及反应条件)，并报告每个核酸目标在阳性质控品和无反转录质控品存在下Cq值的比较结果。

此外，还需对RNA模板进行质量评价。除非提取的总RNA量太低以至于不允许进行质量评价。但产生这种特殊情况是有条件的：从单细胞、血浆、其他无细胞体液、一些激光捕获样品或澄清组织培养基中提取RNA，或提取操作和RT-qPCR测定通过一个连续的、单管实验完成。还需要注意的关键信息包括RNA的数量、完整度、不存在反转录或PCR抑制剂。值得注意的是RNA在体内的降解非常明显，这是mRNA为应对环境刺激而进行的自然调节。研究人员尚不能控制RNA的降解，其表现之一是即使高质量的RNA样品也显示出不同的mRNA降解差异。

A260/A280的吸收度比值必须在中性pH的缓冲盐条件下测定，但如果进行核酸定量分析，特别是测定细胞mRNA浓度微小(<10倍)的差异时，单单提供以上测量信息是远远不够的。还要提供RNA纯度的信息，因为DNA或酚的存在会改变此比值。另外，至少应该提供凝胶电泳的证据，如果可以最好提供rRNA的微流控分析结果或参考基因或靶基因的3'：5'的完整度检测结果。使用Bioanalyzer或Experion系统计算RNA完整度或RNA质量指标数值的优势在于，这种测定提供了RNA样品总体状况的定量信息。但需要注意的是这些数值只是与rRNA的质量有关，而不是测定质量的绝对值。3'：5'分析方法要求两种测定的PCR效率几乎相同，而且受抑制的程度不能有差异。此法对于足以产生可靠结果的RNA质量的阈值标准的界定也是有必要的。理想情况下，测定方法应该以一组“完整性参考基因”为目标，可能没有内含子，3'：5'的阈值比约为0.2-5，显然，我们需要进一步的研究以建立一个普遍适用的、符合成本效益的、简单的程序来评价RNA的完整度。

建议使用稀释的样本或常用的抑制方法如SPUD法检查反转录活性或PCR的抑制作用。如果RNA样本发生部分降解，这个信息一定要报道，这是至关重要的，因为这样可能会使方法检测低浓度转录水平的灵敏度降低，而且由于降解引起的转录水平的相对差异可能会产生不正确的目标比值结果。

DNA样本：

一般情况下，DNA不会产生很大的降解问题。然而，在法医学领域，DNA降解程度的评估是一项很重要的工作，例如在犯罪现场恶劣的环境条件下或大规模灾害或涉及多个失踪人员的案件中，DNA的化学结构可能已经发生降解。PCR分析的小规模扩增有助于最大限度地减少检测有关的问题，但目前已开发的方法主要用于DNA质量的定量测定，我们应该考虑将这些方法用于上述的特定目的抑制剂的存在会给测定结果带来变异，因此文章中必须说明是否存在抑制剂，以确保不影响DNA的测定结果，如病原体检测和相应的定量。在样本中加入阳性质控品的方法可用于检测抑制作用，但不同PCR反应可能会受到不同程度的抑制，这些抑制剂往往是在核酸提取物中与DNA共纯化的物质。因此，常规实验中最好将核酸样本稀释，以证明观察到的Cq或拷贝数的减少与预期结果是一致的，并报告这些数据。

资料来源：2020版MIQE指南

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