多重分析,即在单个反应中检测多个靶标,可以帮助用户节省宝贵的样品,并节省时间、试剂和成本。此外,和做多次单重实验相比,由于多重反应所有靶标都在同一个反应中进行扩增和检测,使得样品和试剂的移液操作误差减少,因此多重检测可以提高定量精度。naica®微滴芯片数字PCR系统的多重检测与单重检测一样灵敏和精准。专业的分析设计和优化可以实现更复杂的多重检测,从而在单个PCR反应中用多对引物和探针扩增多个DNA目标。Crystal Miner软件是一个开放的数据分析软件,可以通过其提供的强大工具来帮助优化和完成多重分析。
评估引物和探针性能的实验指南
1.Stilla建议使用naica® multiplex PCR mix,该试剂设计的初衷是为了得到更好的多重naica®微滴芯片数字PCR系统的实验数据。
2.单重反应测试。在进行多重反应之前,每个引物/探针/模板均需要进行单重性能验证。例如,对于三重分析,在多重反应混合进行之前,首先应对核酸靶标进行三个单重反应。当进行单重反应时,预期结果只出现单一阳性。
3.为了优化多重分析性能,样品性质也是十分重要的因素(例如,游离DNA和基因组DNA需要设计不同的DNA片段,分析游离DNA需要设计成短片段DNA,分析基因组DNA需要设计更完整的DNA片段)。
4.使用的DNA模板应该没有污染物和可能的抑制剂。如果样品材料稀少或不容易获得,可以合成寡核苷酸作为模板分析优化。
5. 评估每个单重反应的退火温度范围,在最佳反应温度下,阳性和阴性微滴分离良好且没有非特异性扩增(图1)。由Crystal Miner软件(图2)提供的Stilla可分离评价可以作为一种度量标准,用于确定所有探针的最佳退火温度。如果单重反应没有被很好地优化,可能会出现明显的非特异性扩增。此外,非特异性扩增可能由几个非优化参数造成。包括引物/探针二聚体或引物/探针非特异性。在这种情况下,可以采用多种方法限制非特异性序列的扩增,如提高退火温度、进行touch down PCR或重新设计引物序列等。实验前可使用相关软件评估引物探针的特异性。
▲图1 :Crystal Miner软件展示单重反应一维点状图,在60°C到65°C退火温度内,
蓝色、绿色和红色荧光通道检测到的荧光强度。黑框部分表示单重反应的最佳退火温度。
可分性评分(e)可用于确定3个靶标扩增的最佳退火温度。(带*数字为可分性评分)
▲图2 :可分性评分是基于阳性和阴性微滴群体的距离。可分性评分是由
Crystal Miner软件自动计算,并可以在高级QC标签栏下找到。
6.在选定的退火温度下,使用所有引物和探针进行多重naica®微滴芯片数字PCR系统,并以区分度为指导,评估反应性能。如果有需要,可从以下几点优化:
★ 调整PCR的循环数——建议从45个循环开始,并增加循环数,以进一步优化阳性和阴性微滴群体之间的分离度。
★ 调整引物和探针浓度——naica®微滴芯片数字PCR系统推荐的引物和探针浓度范围可从0.125到1μM (图3)。对于多重分析的设计建议从较低的浓度范围开始,以减少反应的复杂性,减少引物和探针所占据的体积。
▲图3。Crystal Miner软件的一维点状图显示了一系列引物(左图)和探针(右图)浓度不断增加
时蓝色检测通道中的荧光强度。黑框部分表示良好的可分性评分,及在低引物探针浓度的选择
标准下确定的用于多重分析的引物探针浓度。(带*数字为可分性评分)
★ 使用修饰的碱基,如锁核苷酸(LNA)碱基或小沟结合基团(MGB),以提高探针的Tm值,同时保持较短的长度(可能<20nt)。然而,在多重检测中建议探针添加的MGB不超过2个,以避免扩增减少。
7.评价引物和探针的相互作用:在同一个多重实验中引物和/或探针之间形成同源/异源二聚体的概率应保持在最低。二聚体是可以评估的,相互作用的分数可以用多种工具来确定(例如,IDT Oligo Analyzer Tool, Primer 3, Primer express, Beacon designer) (图4)。高浓度的引物和探针会增加非特异性相互作用的概率。因此,多重分析时,建议所有检测都从低浓度的引物开始(例如,0.25 uM),如果需要,逐步增加浓度至1 uM(例如,提高扩增效率)。
▲图4:引物和探针之间的相互作用示例。a)target 1的探针与target 2的反向引物
相互作用(R2 target 2,红框)。当使用反向引物RI target 2时,没有检测到这种相互作用。在本例中,
应选择RI target 2进行多重检测。b) target 1的探针与target 2的正向引物的相互作用(F2 target 2. 蓝框)。
当使用正向引物F1 target 2时,没有检测到这种相互作用。在本例中,FI target 2应被选择用于多重检测。
8.对于多重分析,荧光溢出补偿是十分重要的。使用多个单色参照,Crystal Miner软件可以创建一个补偿模型用于特定的多重反应。有关荧光溢出的更详细描述,请访问https://www.gene-pi.com/item/spill-over-2/。执行荧光溢出补偿的操作说明请参考Crysta Miner软件用户手册。
naica®微滴芯片数字PCR系统
naica®微滴芯片数字PCR系统,以Sapphire芯片(全自动)或Opal(高通量)芯片为耗材,形成25,000-30,000个微滴的2D阵列,以单层平铺方式进行PCR扩增实验。反应完成后对微滴进行三色通道或六色通道检测,从而对起始核酸浓度进行绝对定量。2.5小时内,可快速获得结果。
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