介绍
多重实时荧光定量PCR为研究多个靶点提供了许多优势。首先,一次PCR检测多个基因省时省力,可以更快地获得结果,同时最大限度地减少使用耗材,如PCR管或板。此外,每个样本可以获得更多的信息,这在样本量有限的情况下尤其重要。最后,由于RNA水平或基因拷贝数在同一反应中直接比较,因此不需要参比染料来校正孔或板之间的移液差异。
在多重实时荧光定量PCR中使用不同荧光标记的靶标特异性探针,可以在不同的荧光通道中检测各靶标基因。与需要进行凝胶电泳分析的终点法多重PCR相比,这消除了对不同片段大小PCR产物的需求。此外,使用靶标特异性荧光探针的反应不会受到非特异性信号的干扰,而非特异性信号一般可能来自次级PCR产物与染料(如SYBR Green)的结合。
▲ 图1:Azure Cielo™新型的高性能光学检测系统。采用16组光纤单孔扫描技术,
可对16孔进行同时成像,以达到更快、更高效的扫描。
多重实时荧光定量PCR已应用于多种研究,例如从基因表达的研究到生物样品中潜在病原体的快速检测和鉴别等1-3。该技术非常强大,甚至已被优化应用到国际空间站微重力环境中4。最近,多重qPCR还被广泛应用于SARS-CoV-2和甲型、乙型流感的鉴别诊断5。
Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统最多可满足6个靶标的多重实验需求。该系统采用16组光纤单孔扫描设计,特殊的激发/发射方式可确保在单孔扫描时仅激发孔内区域,通过消除光散射以消除背景噪声和孔间干扰;而采用单一光源进行整板激发的检测系统,则会发生光散射,导致更高的背景噪音干扰和更少的光线激发样本(图2)。为了提高速度,Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统可16孔同时成像,整个96孔板在9s内即完成6个荧光通道的扫描(图1)。
▲ 图2:单一光源可同时激发孔内和孔外区域,导致更高的背景噪音干扰和更少的光线激发样本。
Azure Cielo采用光纤单孔扫描,可以消除光散射,提高了孔间数据的一致性。
Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统的荧光检测通道兼容大部分qPCR染料可满足不同实验需求(见表1)。
▲ 表1 :Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统广泛兼容多种qPCR化学染料。
为了证明Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统的多重性能,使用人cDNA样本分别进行了单重及6重的RT-qPCR检测。
方法
单重RT-qPCR实验:均使用人cDNA样本,配制各自的20uL单重PCR反应液,2次重复,进行6个荧光通道的检测。
6重RT-qPCR实验:使用250ng至1.95ng的人cDNA样本两倍梯度稀释液,配制20uL的6重PCR反应液,2次重复,进行6个荧光通道的检测。表2中列出了6个靶标基因和各自的探针类型。
▲表2:6个靶标基因和探针类型。
按照如下程序进行qPCR扩增:1x,95℃ 90s;45x,95℃ 15s,60℃ 20s。采用绝对定量对数据进行分析,得到各个基因的Cq值和标准曲线。
结果与讨论
如图3所示,从单重RT-qPCR反应的扩增曲线中看出,各通道之间均没有发生荧光信号溢出或串扰的情况。
▲ 图3:在Azure Cielo™ 6 实时荧光定量PCR系统上进行单重RT-qPCR反应,扫描所有通道的扩增曲线。
6重RT-qPCR实验中各靶标基因的扩增效率和线性动态范围如图4所示,每个靶标的扩增效率均接近100%,且标准曲线的R2值接近于1。
▲ 图4 :6重RT-qPCR实验中各靶标基因的扩增效率和线性动态范围。
以上结果表明Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统具有卓越的多重反应能力以及非凡的检测性能。同时6通道的设计极大程度上提高了实验的灵活性,可选择多种染料类型,方便多重PCR的检测。
Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统
Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统来自于美国Azure Biosystems公司,可为您提供3/6检测通道,根据实验需求灵活配置。这款产品采用了高能LED作为光源系统,可保证光源强度高,光源一致性好;高品质的帕尔贴温度模块作为温控系统,升降温速率快,可设置12列跨度30°C的温度梯度;卓越的CMOS拍照+光纤信号传输作为检测系统,CMOS检测灵敏度高,光纤传输速度快,无光损失和噪音干扰,无需ROX校准。Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统可为您的科学研究提供高精准度、高灵敏度和高可靠性的实验结果。
参考文献:
1. Valasek MA, Repa JJ. The power of real-time PCR. Adv Physiol Educ. 2005;29:151–159.
2. Shin JH, Lee SE, Kim TS, et al. Development of molecular diagnosis using multiplex real-time PCR and T4 phage internal control to simultaneously detect Cryptosporidium parvum, Giardia lamblia, and Cyclospora cayetanensis from human stool samples. Korean J Parasitol. 2018;56(5):419–427.
3. Irshad M, Gupta P, Mankotia DS, et al. Multiplex qPCR for serodetection and serotyping of hepatitis viruses: A brief review. World J Gastroenterol. 2016;22(20):4824–4834.
4. Parra M, Jung J, Boone TD, et al. Microgravity validation of a novel system for RNA isolation and multiplex quantitative real time PCR analysis of gene expression on the International Space Station. PLoS ONE.2017;12(9):e0183480.
5. FDA. (2020). CDC Influenza SARS-CoV-2 (Flu SC2) Multiplex Assay. FDA.Gov. https://www.fda.gov/media/139743.
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