文献分享 | 基于3色荧光通道Naica自动化微滴芯片数字PCR系统平台检测HPV16和HPV18

人类DNA中HPV16和HPV18

的灵敏度和特异性检测

全世界有超过5％的癌症是因人乳头瘤病毒（HPV）导致的，它主要通过性传播的方式感染[1]。十多种HPV亚型由于其在细胞转化中的作用以及宫颈癌和口咽癌发病率的增加而被认为是高风险的。在这些亚型中，HPV16和HPV18是最普遍的，在大约70％的宫颈癌和90％的口咽癌中均能检测到[1]。HPV16和18通过将其病毒序列的片段（包括致癌的E6和E7区域）整合到细胞基因组中，从而使细胞永生并转化。使用能够区分高危型HPV和低危型HPV的灵敏而特异的分子技术，进行早期HPV检测对于治疗癌前病变和预防宫颈癌进展至关重要。在这里，我们展示了使用3色荧光通道Naica^TM自动化微滴芯片数字PCR系统上的检测方法（表1）如何可靠地检测和定量人类DNA样品中的HPV16，HPV18和人类参考基因ALB（图1）。

表1

使用优化的3色Naica^TM自动化微滴芯片数字PCR系统进行HPV分析，在仅包含人类野生型基因组DNA（最终浓度为400 cp /μL）的36个重复样品中，未检测到假阳性，空白限为0。在以人类野生型DNA（最终浓度为400 cp /μL）为背景下对合成的HPV16和HPV18 DNA进行系列稀释，并进行了3次重复，结果检测到HPV16和HPV18基因在95％的置信水平下，最终浓度降至每微升0.2个拷贝，突变等位基因频率为0.05%（图2）。

图1

Crystal Miner软件生成的3D点图，图中同时显示检测到的HPV16、HPV18和ALB参考基因。荧光基团名称显示在括号中。

3色Naica^TM自动化微滴芯片数字PCR系统检测（A）HPV16和（B）HPV18靶标的线性和灵敏度。在400 cp/μL WT-DNA（10000拷贝/25μL反应）的背景下，对HPV16和HPV18的连续稀释样本进行了3次测定，稀释范围为20-0.2 cp/μL（500-5拷贝/25μL反应）。竖线表示95％置信区间下的浓度范围。

患者样本中稳健的

HPV16和HPV18检测

采用3色荧光通道Naica^TM自动化微滴芯片数字PCR系统技术，利用HPV试剂盒对4例口咽癌患者福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织和4例非HPV感染的非小细胞肺癌（NSCLC）患者FFPE组织中提取的DNA进行分析（表2）。口咽部FFPE样本先前使用实时荧光定量PCR进行了检测[2]。采用3色Naica^TM自动化微滴芯片数字PCR系统检测的4份HPV16和HPV18样本均为阳性，非HPV样本检测结果为阴性。

表2

癌症患者FFPE DNA样本中HPV16和HPV18的定量。结果以sapphire芯片中的每微升拷贝数（最终浓度）给出。

应用说明亮点

· 3色荧光通道Naica^TM自动化微滴芯片数字PCR系统能够同时检测和定量HPV16和HPV18以及人类参考基因ALB。

· 在每25μL反应10000个拷贝的野生型DNA背景下，尽管突变等位基因的频率为0.05%，HPV16和HPV18依然能够精准的被检测到，并且在95%的置信区间内没有检测到假阳性。

· 在连续稀释实验中，3色HPV检测显示预期和测量的HPV16和HPV18浓度之间存在良好的相关性。

· 3色荧光通道Naica^TM自动化微滴芯片数字PCR系统成功地检测出口咽癌患者FFPE肿瘤标本DNA中HPV16和HPV18。