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数字PCR之Evagreen染料法
Evagreen染料法数字PCR
Nacia数字PCR之EvaGreen®是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。作为新一代的绿色荧光核酸染料EvaGreen®，具有如下三个优势： 1 对PCR 的抑制小，因此在实验中EvaGreen®可使用快速PCR 温度循环，同时可以使用较高浓度，提高亮度的同时也消除了“染料重新分布”； 2 稳定性极强，在储存、操作和PCR过程中不会被破坏，可以反复冻融； 3 降低了细胞膜透性，更加安全。 染料法dPCR实验反应体系含有一对用于扩增目的序列的特异区段的PCR引物和用于扩增产物使用的EvaGreen®染料。
EvaGreen®实验的步骤如下
1
引物和扩增子设计
引物设计的原则在qPCR和digital PCR中是一样的。具体的设计原则可以参照前面发表的引物探针设计原则。
2
实验准备
对于任何数字PCR实验需要准备：
数字PCR仪及专用耗材
PCR mix包含酶，dNTPs，buffer，Mg+
Evagreen
dH2O
普通PCR实验用品：tube chip 振荡器 离心机等。
3
反应体系
按如下反应体系配置MIX：
4
反应条件
*：根据实验引物的Tm值来决定
5
数据采集
根据所使用的系统，数据采集将采用芯片成像的形式(Naica™系统、QuantStudio™3D数字PCR系统、CONSTELLATION®数字PCR系统……)，或者类似于流式细胞术(QX200™液滴数字PCR系统、Raindrop™数字PCR系统)，逐个读取分区。请按照制造商的说明执行此步骤。
6
数据分析
在EvaGreen digital PCR实验中，只有一个荧光通道需要检查，因此数据将被表示为一维点图。其中每个点表示一个分区，y轴表示蓝色检测通道中各分区的荧光强度，x轴表示分析软件分配给各分区的指标编号。
6.1
数据质控
根据数据采集的类型，数据分析软件可以提供不同的质量控制。应当仔细考虑两项标准：
NTC：NTC只用阴性微滴
总微滴数：大量的可分析分区将减少与测量浓度相关的不确定性
在Naica™系统上，还可以可视化生成的分区:
6.2
阈值设置
通常，阈值是由分析软件自动设置，阈值以上的分区为正，阈值以下的分区为负。因此，设置阈值是数字PCR对定量结果进行处理的一个强制性步骤。由于阈值设置是自动计算，我们建议您查看点一维图。但是，下面两种情况需要手动设置阈值：
●当有非常少的正分区或非常少的负分区时；
●当你观察到正负分区之间有很多雨滴时。
6.3
浓度计算
设置阈值后，软件自动量化每个目标的正分区和负分区的数量。然后，使用泊松分布将这个数字读数转换为拷贝数。每个结果都有一个95%的置信区间，它反映了测量的精度。该方法的精度也可由“95%置信区间”值给出，越小越好!每个样本浓度的95%置信区间及其相关的相对不确定度由分析软件自动计算。如图：
Evagreen数字PCR实验具有设计简单、条件建立快而且成本低等优点，但是 由于DNA结合Evagreen为非特异性结合双链DNA，所以Evagreen方法多用于低通量、单重实验。
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