新方法—LNP-mRNA的转染效率可大幅提升！

前言

在提升LNP-mRNA转染效力的问题上，多数研究者会采用两种方式：1.更换已公开的配方进行尝试；2.开发新的可电离脂质。从逻辑上讲，两种方式都没有问题，但如果对配方过程的优化更深一步，相信新的发现会指引我们更好的解决问题。下文将主要介绍LNP-mRNA合成时酸性缓冲液的变化带来的一系列影响。

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缓冲液类型和浓度的变化诱导泡状结构形成

研究人员采用KC2脂质配方，具体组成为KC2/DSPC/胆固醇/PEG-DMG (50/10/38.5/1.5 mol%)，引入Dil或Dio（荧光染料适用于FRET分析）。在包裹mRNA时使用多种pH4缓冲液，分别为：25 mM NaOAc、300 mM NaOAc、300 mM CitPhos及300 mM Na-citrate，包裹完成后在pH 7.4的PBS中透析。

图1.高浓度pH 4缓冲液中合成的LNP-mRNA可诱导泡状结构的形成并提高体外转染效率

当酸性缓冲液为25 mM的NaOAc时，仅观察到LNP-mRNA“实核”结构，未有明显泡状结构形成（如图1d）；而在300 mM NaOAc、CitPhos及Na-citrate的缓冲条件下，体系分别显示出LNP总面积5%、44%和59%的泡状结构（图1c、e、f、g）。

用不同缓冲条件下制备的LNP-mRNA孵育Huh7细胞，24小时检测其发光强度。如图1b所示，在300 mM条件下制备的LNP-mRNA，其发光强度远高于在25 mM条件下制备的。由此推测，泡状结构的形成有利于增强mRNA的转染效果，但转染效果的增强不能归因于摄取的增加（图2，摄取量未增加）。

可电离脂质的种类影响泡状结构的形成

表2. 不同缓冲浓度下形成的LNP-mRNA粒径、PDI及包封率参数

具有泡状结构的LNP-mRNA可提升小鼠体内转染水平

接下来，研究人员针对KC2和SM-102所在的配方进行体内研究。以0.5 mg/kg的mRNA剂量静脉注射给CD-1小鼠，在注射后3、6、24小时检测生物发光。

如图4所示，与25 mM NaOAc缓冲液相比，使用300 mM Na-citrate缓冲液制备的两种LNP-mRNA在肝脏和脾脏中的基因表达均显著提高，KC2相较于SM-102表现出了更优越的转染效力，且两者在注射后24小时仍可观察到荧光蛋白的表达。

最后，研究人员进行了毒性测试。结果表明，在较高缓冲浓度下制备的LNP-mRNA没有引发更强的毒性。注射后24小时，两种（不同缓冲液浓度下制备）LNP-mRNA制剂的血液学、生物化学及细胞因子参数水平无显著差异（图5）。

图5.LNP-mRNA有无泡状结构系统毒性无显著差异

泡状结构可增强被封装mRNA的完整性

图6.不同缓冲条件下mRNA完整性及翻译能力对比

泡状结构的出现为何能显著提升LNP-mRNA的转染性能，针对此问题，研究人员进行了大量的论述，认为泡状结构的出现增强了被封装mRNA的完整性。此结论或许还需要更多的研究来进行证明，但图6、图7的数据也从某种程度上说明了这种结论的可靠性。300 mM的缓冲条件下，mRNA具有更强的翻译能力，且制成的LNP-mRNA在50% FBS中孵育一段时间后，显示出更好的mRNA完整性。总而言之，这些数据或推论，对于此领域的研究有着重要的指导推进作用。

图7.mRNA完整性检测

结论：

通过对配方过程的深入优化，作者给予我们了一个重要结论，即酸性缓冲液的类型/浓度变化会大大影响LNP-mRNA的形貌及性能，这也为提升mRNA转染效力打开了一扇全新的大门，让研究者在关注可电离脂质开发之余，也关注mRNA的完整性及封装相关的重要参数，诸多考量，多向发力，定能加速此领域开发前进的步伐。