以计算机辅助设计（Computer-aided design，CAD）和计算机辅助制造（Computer-aided manufacturing，CAM）为主题，介绍生物3D打印上游从数据获取、处理到最终生成生物3D打印机能够运行的代码的过程中涉及的技术及其优缺点。目前，计算机辅助设计（CAD）已结合至许多行业，成为设计和制造中不可或缺的技术之一。得益于该技术，设计师能够在用户和最终产品间建起一座视觉桥梁，将抽象的想法呈现在屏幕上。借助计算机，设计师能够快速绘制草稿、优化方案、模拟使用场景，使设计师和用户得以更深入理解某一设计在实际应用中的情况。需要注意的是，CAD并非某一款软件，只要是能够辅助设计师完成产品设计的相关软件，都可视作CAD（同样地，在软件名称中含有“CAD”字样，往往也暗示着该软件的主要功能，图1）。图1 regenHU生物3D打印机附带的BioCAD三维建模软件    CAD&CAM在生物3D打印领域的作用    在生物3D打印领域，尽管重心更多地偏向于生物材料，计算机辅助设计和计算机辅助制造作为实现该领域长期发展的有力工具仍然值得重视。在Murphy的文章中，就将生物3D打印过程分为三个阶段：一、成像与设计；二、材料和细胞的选择；三、组织打印和构建[1]。良好的设计是优秀组织构建的基础，因此我们必须重视CAD与CAM这类辅助技术。在打印过程中，科研工作者常常会使用多孔结构，帮助细胞更好地附着生长。一方面随着打印技术的提升，多孔结构复杂的构型能够被精确地打印出来，另一方面，得益于CAD技术，这些复杂的结构也能够在与材料强度匹配的情况下被绘制出来。    数据获取不论是徒手从零开始绘制一个器官模型，还是直接使用现有的医学影像结果优化，都需要首先获得目标器官的完整数据。在医学领域，科研工作者常使用计算机断层扫描（Computed tomography，CT）、磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）、正电子发射计算机断层显像（Positron emission tomography，PET）、超声等方式获得目标器官的完整图像。这些技术各有优缺点，如CT的优点是空间分辨率高、扫描时间短，缺点则是有辐射；而MRI则没有辐射；超声则兼具便宜、可携带、无辐射、耗电量小等优势，但分辨率却并不理想等。获取的一手图像往往包含多个器官，我们需针对目标器官进行分离。为了使分离变得容易，不论是上述何种成像方式，高信噪比永远是科研工作者期望的重要指标。过低的信噪比将会导致目标器官图像与周边其他不需要的部分融为一体，难以区分。截至目前，已经出现了许多针对不同器官的图像分离算法，但没有任何一个单一算法可以有效解决所有图像分离任务。其中的一个问题是算法会出现遗漏，或把本不该出现的部分算进需要的区域中。当出现算法难以区分的情况，就需要工作者对每一层进行手动划分，这将大大降低效率。因此开发稳定可靠的算法始终是数据获取的重要研究方向。regenHU生物3D打印机附带的BioCUT医学影像分割软件    数据处理原始的三维数据量通常较大，需进行压缩以减少软件处理时的压力。但同时，我们也需意识到，压缩通常意味着数据的丢失——一旦丧失必要的细节，即便成功打印出一个器官，对于科研工作者需要研究的问题也无济于事。因此，涉及生物3D打印的工作者必须权衡数据量和细节保留之间的平衡。完成数据的选择及压缩后，需完成最后一步——转换成生物3D打印机能够运行的代码。即便是三维的图像，对于打印机而言仍然是多层二维图像的堆叠，因此该步骤会涉及三维数据的分层。将数据分层并转为代码的算法通常会包含诸多打印机相关的信息，如材料特性、挤出方法、挤出量、空间位置等等。理想的软件应当在输入生物墨水（即打印材料）后自动生成上述参数，然而受限于目前的技术，实际使用过程中，科研工作者仍然需要不断地自行摸索这些参数。这也是目前众多生物3D打印机公司推出自研墨水的重要原因——省去用户摸索材料性质所消耗的大量时间，提升效率。 讨论 尽管生物3D打印已发展多年，但就技术和生物理论层面仍然处于较为初级的阶段。Cormac[2]认为，生物3D打印所面临的挑战仍然较多，其中一个大挑战便是开发应用更广泛的细胞结构，使得该结构中的细胞具有较长的寿命，同时可对细胞进行各类实验操作。而最终目标则是打印整个器官。这将涉及到各个专业的科研工作者，因此多学科的共同合作至关重要。否则，不同专业所产生的不同需求和目标将会导致额外的研发支出和重复劳作。 参考文献 [1] Murphy SV, Atala A (2014) 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotechnol 32:773–785.[2] Estermann M., Bisig C., Septiadi D., Petri-Fink A., Rothen-Rutishauser B. (2020) Bioprinting for Human Respiratory and Gastrointestinal In Vitro Models. In: Crook J. (eds) 3D Bioprinting. Methods in Molecular Biology, vol 2140. Humana, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0520-2_13

锘海LS18平铺光片显微镜应用案例分享：PVN-交感神经-脂肪回路在慢性应激所致抑郁和胰岛素抵抗中的作用及机制慢性应激会诱发抑郁和胰岛素抵抗，抑郁和胰岛素抵抗之间存在双向关系。然而，这种合并症的机制仍不清楚。近日，发表在《EMBO reports》上的题为“Role and mechanism of PVN–sympathetic–adipose circuit in depression and insulin resistance induced by chronic stress”的研究中，滨州医学院附属医院研究团队提出：起源于下丘脑室旁核（PVN）的大脑-交感神经-脂肪回路在慢性应激引起的抑郁和胰岛素抵抗中发挥作用。在慢性应激下，PVN增加脂肪组织的交感神经支配，并通过AP-1抑制脂肪因子的表达，从而导致抑郁症和胰岛素抵抗的发生。该研究不仅提示白色脂肪组织（WAT）内分泌功能障碍是慢性应激引起的抑郁症和胰岛素抵抗的常见发病机制，而且描述了从大脑到脂肪组织发生的全局动态变化，为改善预防和治疗提供了潜在的干预靶点。在此研究中，慢性束缚应激使得iWAT和eWAT的交感神经支配增加（图1H , I ）。在将伪狂犬病病毒（PRV）接种到WAT中后，PVN神经元被标记，并在束缚应激下被激活。PVN的慢性激活也使得WAT的交感神经支配增加（图4E , F ），并且通过CNO/hM4D系统抑制对束缚做出反应的PVN神经元，可阻断慢性束缚应激对WAT交感神经支配的影响（图5B , C ）。β-肾上腺素能受体拮抗剂L748337不影响慢性约束应激诱导的交感神经支配增加(图6B,C)，但改善了抑郁样行为和受损的胰岛素敏感性。此外，研究人员还发现使用与PVN相同的病毒方法长期激活PV不会影响WAT中的交感神经支配（图EV3I-L ）。该研究中的脂肪组织样品采用锘海LS18平铺光片显微镜进行成像。图1.慢性束缚应激会诱发抑郁样行为和胰岛素抵抗，并增加WAT的交感神经支配H,I.腹股沟WAT(Iwat)和附睾WAT(eWAT)中TH的免疫组织化学染色（左），及组织学数据的统计分析（右）。图4.PVN中的部分神经元被束缚应激激活，且慢性激活会诱发抑郁样行为和胰岛素抵抗E, F. iWAT和eWAT中TH的免疫组织化学染色（左），及组织学数据的统计分析（右）。图5.对束缚应激做出反应的PVN神经元介导WAT中的交感神经支配、慢性束缚应激下的抑郁样行为和胰岛素抵抗B,C. iWAT和eWAT中TH的免疫组织化学染色（左），及组织学数据的统计分析（右）。图6.慢性束缚应激诱导抑郁样行为和胰岛素抵抗需要β-肾上腺素能受体B,C. iWAT和eWAT中TH的免疫组织化学染色（左），及组织学数据的统计分析（右）。图EV3. 对束缚应激做出反应的PV神经元的慢性激活并不影响WAT中的交感神经支配I-L. iWAT和eWAT中TH的免疫组织化学染色（I, K），及组织学数据的统计分析（J, L）。

Thy1转基因小鼠样本不同分辨率成像解析案例1、 微米级空间分辨率透明化方法：锘海组织透明化试剂盒（水性）成像检测物镜：1×  0.25NA Air空间分辨率：2×2×5 μm3视频1. 从左至右，视频画面a：小鼠整脑三维渲染b：选定小鼠大脑内图像2.3×2.3×9 mm3的子区域进行三维渲染c：该子区域的轴向层切展示d：该子区域的横向层切展示。2、 亚微米级空间分辨率（1）透明化方法：锘海组织透明化试剂盒（水性）成像检测物镜：10× 0.5NA  Immerse空间分辨率： 0.6×0.6×1.5 μm3视频2. 对案例一中同一小鼠脑内2.5×4×2.5 mm3的区域以0.6×0.6×1.5 μm3空间分辨率进行三维成像及三维渲染展示。视频3. 对案例一中同一小鼠脑内2.5×4×2.5 mm3的区域以0.6×0.6×1.5 μm3空间分辨率进行三维成像及横向层切展示。视频4. 对案例一中同一小鼠脑内2.5×4×2.5 mm3的区域以0.6×0.6×1.5 μm3空间分辨率进行三维成像及轴向层切展示。视频5. 对案例一中同一小鼠脑内2.5×4×2.5 mm³的区域以0.6×0.6×1.5 μm³空间分辨率进行三维成像，并对成像结果内0.6×0.6×2.5 mm³子区域图像进行放大展示。从左往右，视频画面 a：该子区域的三维渲染 b：该子区域的轴向层切展示 c：该子区域的横向层切展示。3、 亚微米级空间分辨率（2）透明化方法：锘海组织透明化试剂盒（水性）成像检测物镜：40× 0.8NA  Immerse 空间分辨率：0.3×0.3×0.6 μm3视频6. 对透明化后的小鼠脑皮层神经元以0.3×0.3×0.6 μm3空间分辨率进行三维成像及三维渲染展示。4、 亚微米级空间分辨率（3）透明化方法：锘海组织膨胀试剂盒成像检测物镜：1×  0.25NA  Air空间分辨率：2×2×5 μm3 (膨胀后分辨率：0.5×0.5×1.25 μm3)视频7. 对小鼠脑神经元使用试剂盒膨大4倍，采用空气镜获得0.5×0.5×1.25 μm3空间分辨率，视频为三维渲染展示。5、 百纳米级空间分辨率透明化方法：锘海组织膨胀试剂盒成像检测物镜：10× 0.6 NA 空间分辨率：0.5×0.5×0.8 μm3（膨胀后分辨率：120×120×200 nm3）视频8. 对小鼠颈段脊髓透明化膨胀后，以0.5×0.5×0.8 μm3空间分辨率进行成像，膨胀比为~4倍，实际空间分辨率为~120×120×200 nm3，视频为横向层切展示并选取不同区域图像进行放大展示。

‍‍‍‍研究背景：‍半月板由两个纤维软骨组成，位于膝关节的关节间隙内。它的主要功能是增加关节的稳定性，避免周围软组织被挤入关节；同时它具有一定弹性，能缓冲两骨面撞击，吸收震荡，减少摩擦，保护关节。半月板由来自于膝内、外动脉的分支进行血液供应。在普通人群中，大约6% 的急性膝关节损伤要保持半月板修复，在半月板修复过程中维持血液供应是损伤后愈合的关键因素，然而关于半月板血液供应的定量研究目前仍不清楚。‍‍2023年复旦大学附属华山医院李云霞团队在《Cell Journal》上发表题为“Three-Dimensional Imaging and Quantitative Analysis of Blood Vessel Distribution in The Meniscus of Transgenic Mouse after Tissue Clearing”的研究文章，研究中使用了组织透明化、组织三维成像等方法，分析转基因小鼠半月板的血供情况，并定量分析半月板的血管分布，为临床医生提供了更多解剖学参考。Three-Dimensional Imaging and Quantitative Analysis of Blood Vessel Distribution in The Meniscus of Transgenic Mouse after Tissue Clearing技术路线： 研究结果：研究人员利用组织透明化方法对转基因小鼠膝关节半月板进行组织透明化处理，并采用LS18平铺光片显微镜对膝关节进行三维成像（图1），利用图像处理软件对膝关节中半月板进行建模并量化半月板不同区域的荧光信号强度，并对半月板中血管内皮细胞在内的微小组织的三维结构和空间分布等相关信息进行研究。最后，研究人员分析了半月板血管内皮细胞荧光信号强度从而量化了半月板内的血液供应情况：半月板前部血管数量多于后部，后部血管多于中部（图2）；半月板内侧的血管数量多于外侧（图3）。该研究首次应用组织透明化技术和光片显微镜3D成像来研究小鼠半月板的血液供应，为临床半月板修复治疗的研究提供新的研究思路。图1：小鼠半月板三维成像图2：半月板前、中、后部的血液供应图3：内侧和外侧半月板的血液供应

组织透明化试剂盒(亲水型)Tissue Clearing Kit (Hydrophilic)产品介绍：         该试剂盒主要是通过水化作用增加细胞膜流动性，结合去垢剂对细胞膜的通透作用实现对样品去脂的目的，并通过折射率匹配使样品透明。该方法适用于各种生物组织的透明化处理。 产品特点：· 快速、高效。完整成年小鼠脑的透明化仅需5-7天，200 μm的脑切片仅需2分钟。 · 内源荧光蛋白保留效果好，同时兼容免疫染色。· 样本的形态结构保留程度好。 · 可用于对大尺寸生物组织样品及组织切片的透明化处理，并适用各种类型荧光显微镜，如：光片显微镜、共聚焦显微镜等荧光显微镜。 · 采用亲水性试剂，具有高生物安全性。小鼠CNS透明前后对比图：P7兔脑采用不同透明化⽅法对⽐图：成像案例：Thy1-GFP小鼠脑Anti-TH标记小鼠心脏Anti-TH标记小鼠肝注：以上图像均采集自锘海LS18平铺光片显微镜组织膨胀试剂盒Tissue Expansion Kit产品介绍： 利用水凝胶网络将生物大分子原位固定，并进一步实现各向同性的膨胀，从而达到提高分辨率的目的。产品特点：· 快速、高效。完整成年小鼠脑的透明膨胀仅需9-10天。 · 内源荧光蛋白保留效果好，同时兼容免疫染色。· 样品机械强度高，对生物组织结构保护程度好。· 膨胀系数可以调节 。· 多场景适用，可进行完整组织器官及组织切片透明膨胀 。 · 兼容多类型荧光显微镜，如：光片显微镜、共聚焦显微镜等荧光显微镜。以小鼠脑为例透明膨胀流程：不同器官组织透明膨胀效果：成像案例：Thy1-GFP阳性神经元使用试剂盒膨大4倍采用6.3倍放大倍率即可获得0.5×0.5×1.25 μm分辨率Thy1-GFP阳性神经元使用试剂盒膨大4倍采用20倍放大倍率即可获得70×70×200nm分辨率绿色: ChAT-GFP紫色: 感觉神经元轴突注：以上图像均采集自锘海LS18平铺光片显微镜增强型组织透明化试剂盒Enhanced Tissue Clearing Kit产品介绍：该试剂盒采用有机溶剂进行去脂，亲水型匹配溶液进行高折射率匹配。可以在快速透明组织器官的同时，保护内源性荧光蛋白；该试剂盒兼具疏水性透明化方法快速透明组织器官，以及亲水性透明化方法的高生物安全性和高内源荧光蛋白保留的特性。该方法适用于各类软组织的透明化，结合脱钙试剂处理亦可对骨骼等硬组织进行透明化，同时兼容内源荧光蛋白及荧光染色标记。产品特点：· 快速、高效透明样品 · 兼容免疫荧光染色及内源荧光蛋白标记不同器官组织透明化效果：成像案例：成年ChAT-GFP小鼠通过心脏注射Lectin-AF647标记血管，肠道采用增强型组织透明化试剂盒进行透明，LS18平铺光片显微镜进行成像。成像过程中采用488 nm和637 nm激光光源分别激发GFP标记的乙酰胆碱能神经元和Lectin-AF647标记的血管内皮，0.25 NA物镜、6.3 ×变焦用于检测荧光信号实现对肠道乙酰胆碱能神经元和血管之间复杂拓扑结构的可视化 。ChAT-GFP（青色），Lectin-AF647（红色）。成年C57BL/6小鼠通过心脏注射Lectin-AF647标记血管，采用增强型组织透明化试剂盒对肾脏和心脏进行透明，LS18平铺光片显微镜进行成像。成像过程中637 nm激光光源激发Lectin-AF647标记的血管内皮，0.25 NA物镜、6.3 ×变焦用于检测荧光信号实现对肾脏和心脏血管复杂拓扑结构的可视化。注：以上图像均采集自锘海LS18平铺光片显微镜胚胎透明化试剂盒Embryo Clearing Kit产品介绍：该试剂盒提供一种可快速、高效透明厘米量级组织样品的亲水型透明化方法。该方法主要是通过水化作用增加细胞膜流动性，结合去垢剂对细胞膜的通透作用实现对样品去脂的目的，之后通过高折射率匹配使样品透明。该方法适用于低龄胚胎(小鼠胚胎孕龄不大于E15)及类器官的透明化。透明后的样本可采用激光共聚焦显微镜或光片显微镜进行三维成像。产品特点：· 快速、温和透明幼嫩生物组织· 兼容免疫荧光染色及内源荧光蛋白标记· 高生物安全性· 适配各种荧光显微镜成像案例：E14.5天C57BL/6小鼠胚胎采用胚胎试剂盒进行透明化处理，anti-GFAP-AF561（绿色）和Lectin-AF647（紫色）进行标记，LS18平铺光片显微镜进行整体成像。成像过程中采用561 nm和647 nm激光作为激发光源，0.25 NA物镜、6.3× 变焦用于检测荧光信号实现对GFAP和Lectin阳性细胞的三维可视化。E14.5 天C57BL/6小鼠胚胎采用胚胎试剂盒进行透明化处理，PI标记细胞核，LS18平铺光片显微镜进行整体成像。成像过程中采用561 nm激光作为激发光源，0.25 NA物镜、6.3 ×变焦用于检测荧光信号实现对小鼠胚胎所有细胞核的三维可视化。注：以上图像均采集自锘海LS18平铺光片显微镜细胞膨胀试剂盒Cell Expansion Kit产品介绍：本试剂盒利用水凝胶网络将生物大分子原位固定，并进一步实现各向同性的膨胀，从而达到提高分辨率的目的。成像案例：Hela 细胞采用Mito-tracer（黄色）和β-tubulin（绿色）分别标记线粒体和微管并采用细胞膨胀试剂盒进行制样，激光共聚焦显微镜成像膨胀前后对比结果。——

2023年9月18日—9月20日，锘海生命科学在复旦大学高分子科学系完成了LS18平铺光片显微镜的装机培训工作。01装机现场02理论培训&操作练习锘海工程师在仪器安装调试完成后，对用户进行详细培训：①LS18理论与操作讲解并进行实操培训。②数据处理与分析讲解。③协助用户拍摄样本及数据处理练习。03培训反馈培训结束后，用户对培训的结果感到满意，肯定了这次培训的效果。锘海LS18平铺光片显微镜简介锘海LS18光片显微镜是一款具有半自动校准能力的多功能平铺光片显微镜，它能够在同一成像视野大小下，快速平铺多个小而薄的光片（薄度可达1μm）进行分段照明。LS18平铺光片显微镜兼容所有组织透明化方法的样本，可进行多色快速3D成像。并且，结合组织膨胀技术分辨率可达到近70nm。扫码申请锘海生物组织试剂盒试用

应用案例一Defective Uterine Spiral Artery Remodeling and Placental Senescence in a Pregnant Rat Model of Polycystic Ovary SyndromeHu M et al.Am J Pathol. 2023 Sep 7:S0002-9440(23)00315-2.妊娠相关问题被认为与母体子宫螺旋动脉(SpA)重塑损伤有关，但其关联机制尚不清楚。多囊卵巢综合征的两种常见临床表现——高雄激素和胰岛素抵抗是否影响子宫SpA重塑也不清楚。该研究证实妊娠期间大鼠暴露于5-二氢睾酮(DHT)和胰岛素(INS)不仅会导致高雄激素症、胰岛素不耐受和更高的胎儿死亡率；还会使子宫和胎盘中血管生成相关基因表达失调，表现为：胎盘功能不全标志物和细胞衰老相关蛋白表达水平的显著增加。该研究对包含子宫、胎盘和胚胎的完整组织透明化及免疫标记，通过锘海LS18平铺光片显微镜进行全组织成像，CD31和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)用于表征血管在子宫中的分布。结果表明：高雄激素血症和INS抵抗诱导母体子宫血管EC异常并减少SpA重塑。综上，该研究表明多囊卵巢综合征妊娠并发症的增加可能是由子宫SpA重塑、胎盘功能和胎盘衰老问题介导的。应用案例二Single-cell RNA sequencing reveals new subtypes of lens superficial tissue in humansZhu MC et al. Cell Prolif. 2023 Apr 14:e13477.虽然研究人员通过单核RNA测序绘制了人眼前段细胞图谱，然而上皮细胞中是否存在晶状体干/祖细胞亚型以及人晶状体细胞分化的分子特征尚不清楚。该研究通过单细胞测序对18,596个人晶状体浅表组织细胞进行分析，发现两种特异性表达C8orf4和ADAMTSL4的晶状体上皮细胞亚型，一种新型纤维细胞亚型位于上皮附近；一种可能是晶状体上皮干细胞的ADAMTSL4+细胞亚群，并通过生物组织透明化技术和锘海LS18平铺光片显微镜对完整晶状体进行成像，观察不同年龄人晶状体中CD24纤维细胞簇的空间分布，进一步分析了晶状体上皮细胞分化的轨迹。应用案例三Three-Dimensional Imaging and Quantitative Analysis of Blood Vessel Distribution in The Meniscus of Transgenic Mouse after Tissue ClearingSheng H et al. Cell J. 2023 Aug 1;25(8):570-578.半月板的血供状况决定半月板的恢复情况，是制定治疗方案的参考依据。本研究采用组织透明化方法对转基因小鼠双侧膝关节组织用锘海LS18平铺光片显微镜三维成像分析半月板血管内皮细胞，进而使用软件定量分析小鼠半月板血管分布，为今后对人类半月板的评价提供了方便，也为临床医生提供了更多的解剖学参考。应用案例四Spatiotemporal Dynamics of the Molecular Expression Pattern and Intercellular Interactions in the Glial Scar Response to Spinal Cord InjuryGong L et al. Neurosci Bull. 2023 Feb;39(2):213-244.成年哺乳动物脊髓的神经再生能力较差，主要是由于缺乏内在神经元的再生和外源性因素——损伤引起的神经胶质疤痕，抑制或促进再生。本研究利用空间转录组学(ST)构建了脊髓损伤后瘢痕形成过程中小鼠脊髓组织范围内基因表达模式，并局部分析了疤痕区域从前缘到核心的基因表达梯度，以进一步了解疤痕微环境。并通过组织透明化和锘海LS18平铺光片显微镜对小鼠脊髓损伤后形成的疤痕组织进行三维可视化，结果表明：7 dpi时创面层粘连蛋白（Laminin）高度富集，纤维连接蛋白（Fn1）和胶原蛋白（Collagen IV）的表达相对较低。疤痕的空间异质性证实了以前关于疤痕结构的概念，为疤痕形成提供了一些新的线索，并为中枢神经系统损伤的治疗提供了宝贵的资源。应用案例五Three-dimensional topography of eye-specific domains in the lateral geniculate nucleus of pigmented and albino ratsLi H et al. Cereb Cortex. 2023 Aug 8;33(16):9599-9615.正常大鼠初级视觉皮层(V1)中存在眼优势柱(ODCs)，且外侧膝状体背核 (dLGN)的同侧眼区域分离成少数斑块。为了研究dLGN特异性斑块的三维拓扑结构及其与ODCs的关系，研究人员在左右眼注射带有不同荧光标记的顺行示踪剂，通过组织透明化及锘海LS18平铺光片显微镜对LGN进行整体成像，可视化LGN的三维形态，该研究发现从任何角度观察dLGN都呈现为网格状结构，并且在幼鼠睁眼前后发育完成，异常视觉经验影响但不中断网格结构的发育。在白化Wistar大鼠中，dLGN同侧眼区域斑块较少，特别是在中央视野附近。该研究为dLGN同侧斑块如何产生提供了新见解，并揭示了啮齿类与灵长类动物外侧膝状体背核拓扑结构的差异。已发文章2023ScienceDirectDefective Uterine Spiral Artery Remodeling and Placental Senescence in a Pregnant Rat Model of Polycystic Ovary SyndromeCell ProliferationSingle-cell RNA sequencing reveals new subtypes of lens superficial tissue in humansCell JournalThree-Dimensional Imaging and Quantitative Analysis of Blood Vessel Distribution in The Meniscus of Transgenic Mouse after Tissue ClearingSpringer NatureSpatiotemporal Dynamics of the Molecular Expression Pattern and Intercellular Interactions in the Glial Scar Response to Spinal Cord InjuryCerebral CortexThree-dimensional topography of eye-specific domains in the lateral geniculate nucleus of pigmented and albino ratsNature metabolismThermogenic adipocyte-zinc promotes sympathetic innervation in male miceRESEARCHCharacteristic Features of Deep Brain Lymphatic Vessels and Their Regulation by Chronic StressNature materialsRapid fabrication of physically robust hydrogels2022Nature CommunicationsvolumeCarbonized paramagnetic complexes of Mn (II) as contrast agents for precise magnetic resonance imaging of sub-millimeter-sized orthotopic tumorsChinese MedicineThree-dimensional visualization of electroacupuncture-induced activation of brown adipose tissue via sympathetic innervation in PCOS ratsResearch SquareThree-dimensional visualization of electroacupuncture-induced activation of brown adipose tissue via sympathetic innervation in PCOS rats2021ScienceProliferation tracing reveals regional hepatocyte generation in liver homeostasis and repairThe Royal Society of ChemistryConcentrated small extracellular vesicles from menstrual blood-derived stromal cells improve intrauterine adhesion, a pre-clinical study in a rat model2020Cell ReportsA Versatile Tiling Light Sheet Microscope for Imaging of Cleared Tissues中国光学期刊光片荧光显微成像技术及应用进展

研究背景：水凝胶材料显示出多种应用的前景，特别是具有高含水量特征的生物相容性材料。尽管近年来水凝胶技术取得了进步，但其应用往往受到机械性能不足和耗时的制造工艺的限制。       近日，发表在《Nature Materials》上的题为“Rapid fabrication of physically robust hydrogels”的研究中，上海交通大学研究团队提出一种新的“光偶联反应”交联策略，在凝胶化过程中自发形成相分离结构并同步建立两相间的牢固界面，这种水凝胶可在几秒钟内制备出来。由于有效的相间负载转移，该水凝胶具有高韧性（138 MJ m-3）、卓越的拉伸强度（15.31 MPa）、以及媲美弹性体的结构稳定性。该水凝胶可以通过微米级精度的3D打印技术制成各种复杂结构（如支架、管），展现了广阔的应用前景。研究人员通过3D打印技术将水凝胶制成具有两个空腔且缠绕在一起的管状结构，空腔中分别填充Rhodamine或Cy5标记的BSA，空腔的两端用水凝胶密封。成像过程中采用405nm、561nm和637nm激光光源分别激发水凝胶腔壁、Rhodamine-BSA和Cy5-BSA，0.25NA物镜、3.2×变焦用于检测荧光信号实现对复杂管状拓扑结构的可视化（如图1）。图1：3D打印技术制作的水凝胶纠缠网管拓扑结构利用3D打印技术制造的纠缠管状拓扑结构具有两个管腔，分别充满Rhodamine-BSA和Cy5-BSA，并采用LS18平铺光片显微镜进行荧光成像。(i)3D打印结构；(ii)染料填充后的结构；(iii)为(ii)中所选区域的俯视(上)和侧视(下)的荧光伪彩图像。采用锘海LS18平铺光片显微镜进行荧光成像产品链接：可留言申请组织切片透明化&膨胀试剂盒（试用装）

mRNA-LNPs的生成mRNA由DNA转录而来，经纯化后可作为mRNA-LNPs合成的有效载荷。未修饰的mRNA分子会被细胞RNA感应器识别，从而激活先天免疫反应，因此，核苷修饰也被认为是mRNA为基础的治疗领域最重要的突破之一。LNPs通常由四种成分组成：磷脂、胆固醇、“隐形”脂质和可电离脂质。“隐形”脂质常用PEG分子，虽然PEG常被认为是非免疫原性的，但抗PEG抗体已经被检测出来，它的出现会加速LNPs的血液清除并激活经典的补体途径，因此，PEG脂质的占比不能太高；可电离脂质在生理PH值下的中性，则有效避免了阳离子脂质引起的直接炎症毒性。图1. mRNA-LNPs的生成及检测mRNA溶解于PH 4.0的柠檬酸钠（浓度不高于0.1M）缓冲液，四脂质成分溶解于无水乙醇中，两相即可按特定的比例在微流控设备上进行快速合成。mRNA-LNPs的大小和均匀性可通过动态光散射来验证，表面电荷通过ζ电位测量来确定，酶标仪可用来测定样品的包封率，RNA凝胶则可验证有效载荷的纯度及稳定性（图1）。mRNA-LNPs传递至细胞mRNA-LNPs可通过静脉注射等方式进入体内后，通过巨噬细胞和网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。内化后的mRNA-LNPs沿内体途径行进：其内部PH值逐渐降低，阳离子脂质发生质子化，并与内体膜相互作用，从而导致LNPs的破裂，在被溶酶体降解之前，有效载荷mRNA被释放出来，这一过程被称为内体逃逸（图2）。mRNA-LNPs的内体逃逸是非常低效的，但释放到细胞质中的mRNA，则能迅速的被核糖体翻译成所需的蛋白质。      图2. mRNA-LNPs胞内作用过程被动靶向与主动靶向mRNA-LNPs在体内的分布往往呈现随机性，很难按照研究者的设计来进行。总的来讲，mRNA-LNPs的靶向方式可分为两类：被动靶向和主动靶向（图3）。被动靶向不涉及mRNA-LNPs的修饰，更多依赖于不同粒子在不同组织或肿瘤中积聚的固有倾向。在肿瘤学中，这种方法用于靶向可接近的肿瘤以及非恶性组织，如脾脏和淋巴结，以进行抗肿瘤免疫调节。主动靶向则需对mRNA-LNPs进行修饰，使其递送到特定的细胞类型。提高纳米颗粒靶向特定细胞类型的能力是扩大其在临床肿瘤学应用的关键。      图3.被动靶向与主动靶向有两种方法可以功能化LNPs表面的靶向抗体。第一种为：在LNP的配方中加入“锚定”脂质，颗粒制备后，可以将功能配体偶联到其上（图4），多余的配体则通过层析纯化清除。该方法容易偶联不完整或定向不正确的抗体，例如定向暴露Fc区域的抗体，这可能导致不必要的免疫反应并影响药代动力学特征和分布。第二种为：在形成的LNPs中添加ASSET胶束，以孵育的方式进行偶联，后添加靶向抗体，将其Fc区域与ASSET中的scFv结构域相互作用，以此来保持抗体的活性构象并控制其在LNPs表面的方向，该方法已成功地将mRNA有效载荷传递至小鼠特定的免疫细胞群和癌细胞。图4.LNPs功能化抗体策略挑战与展望在预防新冠的过程中，mRNA-LNPs展示了其卓越的功效，但若想扩展其临床应用领域，仍面临着一些需要解决的问题。（1）mRNA-LNPs的不稳定性：非超低温下的不稳定，是由有效载荷mRNA的固有不稳定性所驱动，并非载体LNPs不稳定。（2）炎症反应：LNPs并非惰性的，它可能改变宿主体内细胞因子的水平，引发炎症反应。抗PEG抗体的出现可能导致LNPs的快速清除，从而阻碍治疗效果；可电离脂质过长的半衰期也可能引发不良反应，为提高清除效率，下一代可生物降解脂质通常在其疏水尾部结合不稳定的酯键。（3）特异性和脱靶表达：mRNA-LNPs疗法未来的改进目标即为细胞特异性表达，精准靶向，减少脱靶方可拓展其潜在应用领域。（4）生产复杂性：设备限制在工艺设计过程中容易被忽视，直至临床规模生产，方才意识到工艺放大难题，在药物开发早期，可及时关注生产相关事宜。小 结mRNA-LNPs疗法在诸多疑难疾病的治疗方面展现了巨大潜力，但仍有不少挑战等待研究者们解决 ，随着领域研究的持续深入，此疗法定将做出更大的贡献。参考文献：[1]Kon, E., Ad-El, N., Hazan-Halevy, I.et al. Targeting cancer with mRNA–lipid nanoparticles: key considerations and future prospects. Nat Rev Clin Oncol (2023).铭汰 Microflow 系列微流控纳米药物递送平台

近日，上海市科学技术委员会公布了2023年度科技型中小企业技术创新资金计划拟立项项目，根据《中共中央办公厅、国务院办公厅关于深化项目评审、人才评价、机构评估改革的意见》等文件要求， 共有1290家企业拟入科技型中小企业技术创新资金计划拟立项项目，锘海面向生物和病理组织样本透明化及三维成像的技术服务平台顺利入选。上海市2023年度科技型中小企业技术创新资金计划拟立项项目公示：关于锘海： 锘海生命科学成立于2017年，2020年获得国家高新技术企业资质，2021年7月被列入上海市标准化试点项目单位，项目名称为《光片照明显微镜研发与应用标准化试点》（项目编号：S21-02-025）。2022年被评定为“专精特新”中小企业、上海创新型中小企业，2023年被评为上海第一批科技型中小企业。总部位于上海松江区，在北京，广州，成都，沈阳等十余座城市设有办事处, 作为“生命科学的服务者，医疗创新的推动者“，致力于打造完整的生命科学研发、制造、服务体系。锘海自主研发LS18平铺光片显微镜可实现小鼠全脑、脊髓、骨骼、肾脏、肝脏、乳腺、胰腺、肺、肌肉及肿瘤等小动物完整器官3D结构呈现。“平铺光片技术”解决了传统光片显微镜中空间分辨率、光学层析能力和成像视野大小之间的矛盾，满足高通量、准确定位的荧光成像分析需求，广泛应用于脑科学、肿瘤学、药物研发、干细胞研究、组织胚胎学等各个领域。为方便广大科研工作者，亦提供适用于各类荧光显微镜的组织透明化系列试剂提高成像分辨率以及提供组织透明化、免疫荧光标记、高分辨大组织3D成像、图像分析与存储，一站式科研服务。此外，锘海还有纳米药物制备系统及纳米药物制备、检测服务—从处方筛选到制剂表征全线过程。纳米药物制备系统通过微流控芯片技术制造纳米颗粒包裹体，可包裹化药、mRNA、siRNA、DNA等小分子物质，实现该物质的体内递送，从低通量至高通量均可覆盖，适用于临床前研究和符合GMP的临床生产，并可在纳米颗粒表面添加标记物制造靶向药物。目前，锘海已服务国内多家知名药企并具备成功申报临床的案例。我们拥有一支专业且经验丰富的研发、销售、技术和本地化服务的团队，团队中大多数人员为高学历专业硕博人才，致力于为生命科学领域的科研及企业客户提供个性化、专业化的产品、服务和整体解决方案，让生命科学更加简单、高效。扫码申请试剂盒试用装

在生物3D打印中，结合细胞生物学和生物材料学并应用于组织工程和再生医学已颇具规模。层出不穷的新颖打印材料往往具有一定精准的生理特性，使得控制细胞在打印前后的存活、状态、变化规律等成为可能。因此通过这些材料构建三维生物组织，我们可以专注于成熟、未成熟细胞的体内微生理环境（Microphysiological environment），例如健康或病理状态下细胞的生长、分子的清除和相互作用等。 理解和控制我们需要对生物和非生物成分都有清晰的理解和控制，否则会导致细胞存活率等结果有巨大差别。一个比较基础的方向是研究细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的影响，从非生物成分（即材料）方面，可以通过以下特性进行调整：1、表面特性：形貌（Topography，如微米、纳米级）2、力学特性：模量（Modulus）、柔软度（Softness）3、形态特性：多孔（Porosity）、形状（Shape）4、电学特性：通过材料刺激或细胞内离子流动影响而在生物成分上，优化和质量保证的细胞处理过程始终是至关重要的点，因此我们需要对其进行质量控制（Quality control），即从细胞最初的获得与保存开始，细胞培育，打印前与其他材料的混合，到打印后在打印的支架上培养、分化、表征全程都需要严格的把控。 细胞准备过程的质量保证图1展示了以诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell，iPSC）为例的细胞准备过程。该流程系作者基于之前发表的文章中关于cGMP临床级人类胚胎干细胞分化、保存流程稍作调整获得，着重于流程对于不同种类细胞的普适性，并可通过加入多个确认环节降低风险[1]。确认方式可以是简单的宽场显微镜观察，也可以是更为复杂的实验方法，诸如染色体核型异常（Karyotyping chromosome anomaly）、内毒素测试（Endotoxin testing）等。图1 iPSC细胞系分化、培养及储存的质控流程图在图1中，作者首先进行的是滋养层细胞（Feeder cell）的培养。滋养层细胞指一些特定细胞（如颗粒细胞、成纤维细胞等已在体外培养的细胞），经有丝分裂阻断剂处理后所得的细胞单层。在这一层滋养细胞上，干细胞能够更好地附着、生长。在将体细胞重编程并获得克隆细胞群后，进行机械繁殖（Mechanical propagation）过程，并最终获得iPSC。机械繁殖是通过细胞刮刀或组织切片机将完整培养基及培养的细胞切成若干区域，而后转移至新培养皿进行培养增殖的过程[2]（图2）。图2 A：机械繁殖流程图。B：（i）用胶原酶增殖的人胚胎干细胞；（ii）McIlwain组织切片机；（iii）改进型斩臂（箭头）；（iv）切割后的单个细胞群显微图。C：使用自动剪切（i、ii）和酶传代（iii-iv）传代后的代表性细胞群片段。比例尺100 μm。 打印过程的质量保证基于图1的iPSC准备过程，图3展示了其后续生物3D打印流程。需要注意的是，不论细胞还是生物材料，都需要保证其无菌性，以减少整个过程中的污染风险。图3 生物组织3D打印的质控流程图 小结在上述准备细胞、打印细胞的过程中，需时刻意识到任何的QA过程都应有成本上的考量（时间和金钱），尤其在GMP级生产中。与其在无法达到某一标准时推倒重来，不如一开始就把一系列质量要求写入标准中，以减少重复工作带来的长线额外支出。

2023年8月9日—8月11日，锘海生命科学在松江中心医院完成了LS18平铺光片显微镜的装机培训工作。装机现场‍‍理论培训&操作练习‍‍锘海工程师在仪器安装调试完成后，对用户进行详细培训：①LS18理论与操作讲解并进行实操培训。②数据处理与分析讲解。③协助用户拍摄样本及数据处理练习。培训反馈培训结束后，用户对培训的结果感到满意，肯定了这次培训的效果。锘海LS18平铺光片显微镜简介锘海LS18光片显微镜是一款具有半自动校准能力的多功能平铺光片显微镜，它能够在同一成像视野大小下，快速平铺多个小而薄的光片（薄度可达1μm）进行分段照明。LS18平铺光片显微镜兼容所有组织透明化方法的样本，可进行多色快速3D成像。并且，结合组织膨胀技术分辨率可达到近70nm。

RNA-LNP常通过两相自组装反应进行制备，一相为载体脂质相，另一相为包含API（活性药用成分）的水相，制备所需的设备则是我们已熟知的——微流控设备。构效关系，可理解为药物的理化性质与其药用活性之间的联系。功效先行，理论滞后，是社会中常见的行事逻辑和行为方式，在mRNA-LNP研究领域也不例外，包括已上市的药物在内，其构效关系也未有清晰准确的阐明。mRNA-LNP合成过程所涉及的微观动力学尚未清楚，而合成后mRNA-LNP表征手段的不足则更为构效关系的探索增添一份难度。诸多的疑问等待解答：单个纳米颗粒可以装载多少mRNA，mRNA-LNP的包封率和空壳率有着怎样的关系？后处理过程会改变脂质的分布吗？脂质本身的分布是怎样的？如何准确、定量地表征单个纳米颗粒的组分和载药量？这些问题的解答对于实验的设计，工艺的优化，质控的提升，临床风险的降低有着重要的指导作用。对于研究者而言，在细胞/动物实验的基础上，丰富表征手段仍为突破问题的核心。如图1，mRNA-LNP有各式各样的结构模型，用一些常见的表征，如粒径、PDI、包封率检测等，很难了解其真实样貌。图1. mRNA-LNP模型图冷冻电镜（Cryo-EM）冷冻电镜适用于观测温度敏感型样品，是在普通透射电镜上加装样品冷冻设备，以降低电子束对样品的损伤，减小样品的形变，从而得到更加真实的样品形貌。图2.LNP的Cryo-EM表征图2中，A-C直观展示了纳米粒子（复必泰）的形态及粒径分布，也呈现了粒子内部的一些模糊形态；而D则更为清晰的显示出脂质体内水相中硫酸多柔比星晶体的棒状形态。小角度X射线散射（SAXS）SAXS是指当X射线透过样品时，在靠近原光束2°～5°的小角度范围内发生的散射现象。X射线穿过样品时，在不均一材料电子密度起伏的作用下，会发生散射并形成特定的散射图案，根据所得图案可反推样品微观结构。在进行mRNA-LNP表征时，SAXS常与Cryo-EM结合使用，正如图3所示，结合SAXS检测所得曲线与Cryo-EM拍摄所得图像，即可帮助研究者推断/验证诸多信息，如LNP的多层状结构，各种脂质的排布，纯化前后脂质排布的变化及不同脂质浓度、不同NP比对脂质排布的影响。图3.LNP的SAXS表征多激光圆柱照明共聚焦光谱（CICS）此方法旨在从单粒子水平上定量解析LNP的有效载荷，通过对LNP不同组分荧光标签的一致性分析和单mRNA荧光的定量解析（图4），区分未封装的mRNA、空载的LNPs和负载mRNA的LNPs。以DLin-MC3基准配方来讲，不同条件下，LNP自组装的空载率为40%~80%，非空载的LNP大多含有2~3个mRNA分子。CICS为揭示LNP动力学控制提供了观测条件，也为mRNA-LNP构效关系的研究给予了新的帮助。图4. LNP的CICS表征单粒子分析器（SPP）SPP采用市售共聚焦显微镜，基于溶液中数千个扩散粒子的荧光波动进行分析（图5a）。简而言之，荧光标记的粒子在衍射受限的观察体中扩散，其发射的荧光在多通道中被连续检测，使用自定义的免费Python脚本可识别多通道的荧光强度波动（图5b），基于多通道中每个单峰的强度，可以构建信号密度图（图5c）和每个通道的直方图（图5d）。在包封分析中，SPP通过测量mRNA和脂质染料的共现信号（图5f），可以对单个LNP中mRNA的含量进行定量分析，以得到完整LNP的占比（图5g），以及单个LNP的mRNA包封量（图5h）。 图5.LNP的SPP表征          创建自组装动力学，完善表征手段是揭示mRNA-LNP构效关系的必要方式，文中提到的表征方法，对mRNA-LNP的研究起到了很大的帮助作用，相信随着科技的发展和相关理论的完善，此领域的研究将会取得更大的进展。

背景尽管光声现象早在19世纪80年代便已发现，但直到近几十年才作为一种分子成像（Molecular imaging）方式渐渐为大家所了解。在光声成像（Photoacoustic imaging）之前，分子成像方法层出不穷，如计算机辅助断层扫描（Computed tomography，CT)、核磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）、正电子放射断层扫描（Positron emission tomography，PET）等，一定程度上减慢了光声成像的发展。但近年来，因为上述技术的某些不足，如PET空间分辨率较差、CT仅提供解剖信息且具有辐射危险，所以兼具光学和声学成像优势的光声逐渐被重视。在上一篇推文《光声科普 | 光声信号原理及常见显影剂》 中，我们系统地介绍了光声的产生机理以及常见的显影剂。既有显影剂种类、功能、信号强度等选择有限，因而需不断开发更有针对性、信号强度更高的光声显影剂。改变光声信号的设计原理本质上，开发新的光声显影剂即调整探针分子的量子产率、消光系数、光热转换效率、热声转换效率等特性。具体的调整与光声信号产生一样可以分三个步骤进行：光吸收过程、光热转换过程和热声转换过程。本篇主要介绍基于光吸收过程进行的分子调整原理。基于光吸收过程的光声探针设计原理光吸收意味着探针携带的电子从基态跃迁到激发态，而基态和激发态之间的能量差（能级差）决定了该探针独特的吸收光谱。对于一种化合物而言，其摩尔消光系数越大，捕获光子的能力越强，相同条件下得到的吸收峰值越大。因此，通过扩大探针与目标结合前后的消光系数、吸收光谱差异，便可以显著增加光声信号强度。目前，科研工作者主要通过以下几种特性进行调整（图1）。图1 四种用于调整光声信号的特性  等离子体耦合效应（Plasmon coupling effect）当等离子体纳米结构中粒子间的距离很接近（与粒子大小接近）时，有限的空间会产生强烈的振动，部分振动能量以热的形式发出，从而形成光声信号。通过分离和聚集金属纳米粒子，就可以有效增加或减少等离子体耦合效应。同时，等离子体耦合效应会导致等离子体能带的谱移：金属纳米粒子的分离通常会造成光谱的蓝移；聚集则可能造成光谱的红移。红移常伴随消光系数的显著增加，从而有助于开发可激活的光声探针，例如金纳米粒子（Gold nanoparticles，AuNPs）。  分子内电荷转移（Intramolecular charge transfer，ICT）通过π桥连接供电子部分（Electron-donating moiety，D）和得电子部分（Electron-accepting moiety，A）的分子能够在不同的环境（如不同溶剂）下发生分子内电荷转移。当该分子与成像靶点结合后，因靶点分子的影响，使得D、A两部分分离程度发生变化，从而改变信号强度或位置。例如用靶向基团修饰供电子部分，会降低供电能力，从而使光谱蓝移；而当该修饰有靶向基团的分子与靶点受体结合后，靶向基团与供电子部分分离，能够提升供电能力，从而使光谱红移。这种变化通常成比例发生，因而为该探针提供了一种内置校准，减少环境干扰。文中便介绍了二苯胺基团作为供电子官能团实现一氧化氮检测的案例。  共轭效应（Conjugation effect）能够形成共轭π键的体系具有离域p电子，能够在整个共轭体系中移动，使其具有更为活泼的性质，能以更低的能量进行激发。而这也是使用共轭效应进行探针设计的一个策略：通过调整探针分子的共轭程度，使其具有不同强度的光声信号，即实现“开关”功能（图2）。图2 通过共轭效应开发的可开关光声探针  J聚集效应（J-aggregation effect）J聚集通常会导致吸收峰的红移并增强消光系数。与分子内电荷转移相似，该效果也通常成比例发生。例如在Dai等人的研究中，通过对纳米尺寸的吲哚菁绿进行J聚集（图3），使得J聚集吲哚菁绿的吸收峰从原来的780 nm红移至895 nm，其光声信号也有相同的红移（图4）。  图3 吲哚菁绿J聚集示意图图4 J聚集吲哚菁绿吸收、光声信号均发生红移

7月28日-30日为期3天的会议圆满结束，CNS作为我国神经科学领域规模最大的学术会议,锘海十分重视此次活动，携带样机样本，让来到展位的老师都能沉浸体验锘海产品。‍‍‍‍快速成像体验了锘海LS18平铺光片显微镜的老师，对于产品整体成像、成像深度、成像速度高度认可，并现场交流了目前相关研究所遇到的问题，锘海工作人员进行了详细解答。组织透明化现场陈列了小鼠各类组织透明化后样本，老师在看到锘海制作的样品同时现场体验了脑片透明化的全过程，对于透明化的程度以及透化速度表示认可。上手体验在看到膨胀化的小鼠脑后，老师十分好奇，现场感受了样本的机械强度以及透化程度。感谢各位老师对锘海生命科学的关注与认可，期待与您下次再见。

会议介绍光学显微镜成像是细胞研究的重要技术手段，在揭示细胞形态、动力学、相互作用和定位等方面都起到了重要的作用。特别是近几年显微成像技术的快速发展使得研究人员能够“见所未见”。但是纷繁芜杂的各类显微镜和不断更新的技术，使得研究人员经常觉得无从选择，甚至错误选择了无法实现研究目的的显微镜，浪费了大量的人力和经费。因此，正确选择并科学使用显微成像技术至关重要。鉴于此，组织单位特举办“活细胞与超高分辨成像高级研讨会”。本会议邀请了国内在显微成像领域有着深入研究的知名专家进行授课，并通过仪器实操展示技术如何助力科研，从而为科学选择和正确使用显微成像技术并推动细胞生物学研究的快速发展做出贡献。锘海生命科学将参与此次研讨会并做现场报告以及现场成像演示，诚邀您参与报名。会议信息01会议时间理论研讨：2023 年 8 月 7 日-9 日上机实操：2023 年 8 月 10-12 日02会议地点中国北京，清华大学03锘海报告主讲人：高亮主题：使用生物组织透明化、膨胀、和平铺光片显微镜技术解析小鼠脊髓运动神经网络展会核心产品01 锘海LS18平铺光片显微镜      锘海将携平铺光片显微镜产品资料和成像视频，向您展示生物组织透明化结合光片显微镜呈现快速高分辨率的生物组织三维成像案例，可广泛应用于神经科学、脑科学、胚胎发育学、肿瘤生物学、细胞生物学、药效评价和医学影像等领域。锘海LS18平铺光片显微镜成像展示：02 3D成像科研服务     锘海生命科学搭建了一站式服务平台，为广大客户提供专业的生物组织透明化、免疫染色、平铺光片显微镜3D荧光成像、数据分析、数据存储等一站式科研服务，旨在通过精细、快速、多样化的科研服务为每一位生命科学工作者提供个体化/定制化的解决方案。03 生物组织透明化试剂盒（水性）  该试剂盒主要是通过水化作用增加细胞膜流动性，结合去垢剂对细胞膜的通透作用实现对样品去脂的目的，并通过折射率匹配使样品透明。该方法适用于各种生物组织的透明化处理。 04 生物组织膨胀试剂盒   利用水凝胶网络将生物大分子原位固定，并进一步实现各向同性的膨胀，从而达到提高组织分辨率的目的。      锘海诚挚邀请您参与第四届活细胞与超高分辨成像高级研讨会，现场有锘海专业工程师与您探讨交流技术难点及实验步骤并做现场演示解答，欢迎各位老师莅临咨询！

      近年来，核酸脂质纳米粒（Lipid nanoparticle，LNP）已成为一种常用的核酸药物递送系统，可有效包裹、保护和递送多种核酸（如mRNA、siRNA、pDNA等）进入细胞，避免核酸被核酸酶降解，并在到达溶酶体前将核酸释放到细胞质发挥相应的作用。LNP拥有诸多优势，如包封率高、细胞转染率高、组织穿透能力强以及低细胞毒性和免疫原性。为了得到均一、稳定的LNP，微流控技术是目前较为先进、主流的方法。本文主要为大家介绍微流控技术制备核酸脂质纳米粒的基本原理。                                   微流控技术制备核酸脂质纳米粒的核心原理微流控技术是一种通过几十至几百微米的微通道结构，处理、加工或操控微小流体的技术。微流控技术通过微流控设备精确控制流体流速、设计一定形状的微通道及程序化混合工艺，精确合成核酸脂质纳米粒。该方法制备条件温和，速度快，易于生产放大，其合成的纳米粒的形貌、结构、粒径分布均一，批次间重复可控。通过微流控技术制备核酸脂质纳米粒的核心原理主要有两方面：层流效应及自组装反应。01 层流效应层流是流体作层状流动的状态，其质点沿着与管轴平行的方向作平滑直线运动。雷诺数（Reynolds number, Re）是用来表征流体流动情况的无量纲数，由英国物理学家奥斯本·雷诺（Osborne Reynolds）首次提出。利用雷诺数可区分流体的流动状态（层流或湍流），也可用来确定物体在流体中流动所受到的阻力。雷诺数的计算公式为：其中，ρ是流体密度，v是流体流速，d是管道直径，μ是流体的动力粘度。在管流中，当Re小于2300时，流动为层流，黏性力的影响远大于惯性力，使得其流体动力学的性质可预测。当Re等于2300～4000时，流动为过渡状态。当Re大于4000时的，流动为湍流，惯性力占主要地位。举例来说，无水乙醇在25℃，300 μm的微通道中以12 mL/min的流速进行流动，ρ乙醇=785 kg/m3；μ乙醇=0.001096 Pa.s可以判定该条件下，无水乙醇的流动状态为层流。图1 管道中流体状态（（a）层流：染料是通过分子扩散与主流混合；（b）过渡状态：染料条纹为波浪状，但主流仍为层流；（c）湍流：染料条纹不稳定的改变方向，并且由于速度波动，染料与主流混合）02 自组装反应自组装（Self-assembly）反应是指脂质分子在非共价键的相互作用下，自发组织、聚集形成稳定且具有一定几何外观的有序结构的过程。典型的核酸脂质纳米粒主要由四种脂质组成：可电离的阳离子脂质、辅助性脂质、PEG脂质以及胆固醇（图2）。通常将脂质和核酸分别溶解于无水乙醇（有机相）和酸性缓冲液，如0.1 mol/L  pH4.0的柠檬酸缓冲液（水相）中。然后，水相、有机相以一定的流速比（如3:1），在微流控纳米药物制备系统中混合，触发自组装反应，形成核酸脂质纳米粒。图2 核酸脂质纳米粒示意图阳离子脂质的结构一般分为三部分：可电离氨基的亲水头基、连接键和疏水尾部（图4）。阳离子脂质的亲水氨基头部在酸性缓冲体系中，被质子化呈正电。当水相与有机相接触时，正电的阳离子脂质和核酸中大量的负电磷酸根，通过静电相互作用结合，从而将核酸封装在LNP内。图3 阳离子脂质化学结构示意图辅助性脂质又称中性脂质，含有亲水基团和疏水基团，当与水相接触时，辅助性脂质及阳离子脂质的疏水基团聚集在一起，而亲水基团伸向水部，发生自组装反应，形成脂质双子层。PEG脂质是一种两亲性大分子化合物，由疏水头部和PEG亲水尾部构成。当与水相接触时，其疏水头部与辅助性脂质、阳离子脂质的疏水基团聚集在一起。PEG长链由于亲水性和大体积，主要位于LNP的外壳上，为LNP提供了一个外部聚合层，以阻止血清蛋白吸附和单核吞噬细胞系统的摄取，从而延长了体内的循环时间。PEG长链还可以增大LNP的空间位阻，防止纳米颗粒团聚，PEG脂质的含量对LNP的大小也有重要影响。此外，可以对PEG脂质进行靶向修饰，如与配体或生物大分子偶联，实现LNP的靶向递送。胆固醇通过填充磷脂间的空隙来调节膜的流动性，当与相变温度低的磷脂结合时，可降低膜流动性，增加双层膜的厚度；当与相变温度高的脂质结合时，能够提高膜流动性并使双层膜变窄。此外，胆固醇的加入可以调节膜的完整性和硬度，减少LNP中药物的渗漏，对LNP的转染效率有显著影响。脂质成分及组成对LNP的粒径、PDI、包封率、稳定性、转染效力和安全性等起着重要作用。更多脂质成分作用，可以查看往期推文具体介绍：脂质纳米颗粒中各成分的作用图4 核酸脂质纳米粒成分组成03 微流控芯片微流控纳米药物制备系统的核心是微流控芯片，是实现水相、有机相层流效应及控制两相中的有效成分发生自组装反应的场所。微流控通道的体积极小，通过微流控设备精准调控两相液体的流速，可使两相液体以层流的形式，在极小的相界面快速发生自组装反应，反应时间通常在3 ms以内。微流控芯片就像一个微量定量的精准反应器，通过对流体的控制和加剧混合来迅速得到大小均一、重复性好的脂质纳米粒。图5 微流控反应示意图铭汰的微流控芯片采用的是圆环形芯片设计，通过特殊设计的圆环，实现液体多次分流并多次以层流的形式发生自组装反应，加快反应速度，易于形成粒径分布均一可控，重复性好的纳米颗粒。另外，圆环形的芯片设计，方便芯片的清洗，可增大芯片的重复使用次数。同时，铭汰全产品线微流控设备，采用相同的芯片核心结构设计，有利于实现脂质纳米粒合成放大前后效果一致。图6 圆环形微流控芯片反应示意图小结：通过以上的介绍，相信大家对于微流控技术制备核酸脂质纳米粒的原理已经有了比较清晰的了解。通过精密的微流控设备及微流控芯片，一方面，实现两相液体的层流效应；另一方面，控制有效成分在相界面间的自组装反应。铭汰提供微流控纳米药物制备全系列产品，可以为客户提供一站式的解决方案。

会议介绍中国解剖学会组胚分会主办、遵义医科大学基础医学院承办的中国解剖学会组胚分会学术年会（2023）、第十八届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会将在2023年7月16日-19日在贵州省遵义市召开。此次会议旨在加强我国医学院校组胚教师、研究生间的科研与教学的交流/协作。届时将邀请我国组织学与胚胎学届的前辈、知名专家和全国同行分享组织学与胚胎学的发展成果，努力为青年教师与研究生搭建广泛交流平台。会议信息01会议时间2023年7月16日-19日02会议地点遵义医科大学03锘海报告报告人：高亮  西湖大学时间：7月17日  09:25-09:50题目：透明化生物组织的三维成像技术与应用报告人：冯瑞丽  锘海应用科学家时间：7月18日  10:20-11:05主题：小鼠整体-器官-全胚胎的三维显微成像展会核心产品01锘海LS18平铺光片显微镜      锘海将携平铺光片显微镜产品资料和成像视频，向您展示生物组织透明化结合光片显微镜呈现快速高分辨率的生物组织三维成像案例，可广泛应用于神经科学、脑科学、胚胎发育学、肿瘤生物学、细胞生物学、药效评价和医学影像等领域。02 3D成像科研服务     锘海生命科学搭建了一站式服务平台，为广大客户提供专业的生物组织透明化、免疫染色、平铺光片显微镜3D荧光成像、数据分析、数据存储等一站式科研服务，旨在通过精细、快速、多样化的科研服务为每一位生命科学工作者提供个体化/定制化的解决方案。03  铭汰微流控纳米药物递送平台       锘海将向您展示纳米药物制备系统及纳米药物制备、检测服务—从处方筛选到制剂表征全线过程。纳米药物制备系统通过微流控芯片技术制造纳米颗粒包裹体，可包裹化药、mRNA、siRNA、DNA等小分子物质，实现该物质的体内递送，从低通量至高通量均可覆盖，适用于临床前研究和符合GMP的临床生产，并可在纳米颗粒表面添加标记物制造靶向药物。04 生物组织透明化试剂盒（水性）  该试剂盒主要是通过水化作用增加细胞膜流动性，结合去垢剂对细胞膜的通透作用实现对样品去脂的目的，并通过折射率匹配使样品透明。该方法适用于各种生物组织的透明化处理。 05 生物组织膨胀试剂盒   利用水凝胶网络将生物大分子原位固定，并进一步实现各向同性的膨胀，从而达到提高组织分辨率的目的。锘海诚挚邀请您参观我们的展位，现场有锘海专业工程师与您探讨交流技术难点及实验步骤，欢迎各位老师莅临咨询！

会议介绍亚洲重要的分析、实验室技术和生化领域专业博览会——第十一届（analytica China）即将于2023年7月11-13日在国家会展中心（上海）8.2H、1.2H、2.2H拉开帷幕。本届展会展示总面积近80,000平方米，预计将吸引来自逾30个国家及地区的1,200+家中外优质展商及36,000多名专业观众共襄盛举。锘海生命科学诚邀您莅临探讨。会议信息01会议时间2023年7月11日-13日02会议地点国家会展中心（上海）03锘海生命科学展位8.2H A515往期展会瞬间展会核心产品01锘海LS18平铺光片显微镜      锘海将携平铺光片显微镜产品资料和成像视频，向您展示生物组织透明化结合光片显微镜呈现快速高分辨率的生物组织三维成像案例，可广泛应用于神经科学、脑科学、胚胎发育学、肿瘤生物学、细胞生物学、药效评价和医学影像等领域。02 3D成像科研服务     锘海生命科学搭建了一站式服务平台，为广大客户提供专业的生物组织透明化、免疫染色、平铺光片显微镜3D荧光成像、数据分析、数据存储等一站式科研服务，旨在通过精细、快速、多样化的科研服务为每一位生命科学工作者提供个体化/定制化的解决方案。03  铭汰微流控纳米药物递送平台       锘海将向您展示纳米药物制备系统及纳米药物制备、检测服务—从处方筛选到制剂表征全线过程。纳米药物制备系统通过微流控芯片技术制造纳米颗粒包裹体，可包裹化药、mRNA、siRNA、DNA等小分子物质，实现该物质的体内递送，从低通量至高通量均可覆盖，适用于临床前研究和符合GMP的临床生产，并可在纳米颗粒表面添加标记物制造靶向药物。04 生物组织透明化试剂盒（水性）  该试剂盒主要是通过水化作用增加细胞膜流动性，结合去垢剂对细胞膜的通透作用实现对样品去脂的目的，并通过折射率匹配使样品透明。该方法适用于各种生物组织的透明化处理。 05 生物组织膨胀试剂盒   利用水凝胶网络将生物大分子原位固定，并进一步实现各向同性的膨胀，从而达到提高组织分辨率的目的。锘海诚挚邀请您参观我们的展位（8.2H A515），现场有锘海专业工程师与您探讨交流技术难点及实验步骤，欢迎各位老师莅临咨询！

会议介绍中国神经科学学会第十六届全国学术会议暨第二届中日韩国际会议（简称CNS 2023&The CJK-2nd）将于2023年7月27日-30日在珠海召开。作为我国神经科学领域规模最大的学术会议，其学术质量在国内屈指可数。2023年，中国神经科学学会联合日本神经科学学会、韩国脑与神经科学学会积极组织召集专题研讨会，通过多轮投票筛选确定58个专题研讨会。锘海生命科学（展位号：T6)  将在现场进行试剂盒试用、现场成像、技术报告等活动，诚邀您参与，欢迎填写问卷报名参加。展会核心产品01 锘海LS18平铺光片显微镜      锘海将携平铺光片显微镜产品资料和成像视频，向您展示生物组织透明化结合光片显微镜呈现快速高分辨率的生物组织三维成像案例，可广泛应用于神经科学、脑科学、胚胎发育学、肿瘤生物学、细胞生物学、药效评价和医学影像等领域。锘海LS18平铺光片显微镜成像展示：小鼠整脑神经成像小鼠中枢神经小鼠心脏神经小鼠心脏血管小鼠肝脏神经小鼠肺神经02 3D成像科研服务     锘海生命科学搭建了一站式服务平台，为广大客户提供专业的生物组织透明化、免疫染色、平铺光片显微镜3D荧光成像、数据分析、数据存储等一站式科研服务，旨在通过精细、快速、多样化的科研服务为每一位生命科学工作者提供个体化/定制化的解决方案。03 生物组织透明化试剂盒（水性）  该试剂盒主要是通过水化作用增加细胞膜流动性，结合去垢剂对细胞膜的通透作用实现对样品去脂的目的，并通过折射率匹配使样品透明。该方法适用于各种生物组织的透明化处理。 04 生物组织膨胀试剂盒   利用水凝胶网络将生物大分子原位固定，并进一步实现各向同性的膨胀，从而达到提高组织分辨率的目的。      锘海诚挚邀请您参观我们的展位（T6），现场有锘海专业工程师与您探讨交流技术难点及实验步骤并做现场演示解答，欢迎各位老师莅临咨询！

会议介绍7月6-7日，NAV第二届核酸疫苗及新型疫苗峰会将于北京新世纪日航饭店召开。【NAV第二届核酸疫苗及新型疫苗峰会】从全球疫苗研发进展、核酸与新型疫苗研发的壁垒到商业化。将全方位、多角度深度探索核酸与新型疫苗领域的热点与挑战，助力中国疫苗更快落地与上市！欢迎各位业内人士莅临锘海展位交流探讨。会议信息01会议时间2023年7月6日-7日02会议地点北京新世纪日航饭店2 楼中华厅03锘海生命科学展位B2展会核心产品01  铭汰微流控纳米药物递送平台       锘海将向您展示纳米药物制备系统及纳米药物制备、检测服务—从处方筛选到制剂表征全线过程。纳米药物制备系统通过微流控芯片技术制造纳米颗粒包裹体，可包裹化药、mRNA、siRNA、DNA等小分子物质，实现该物质的体内递送，从低通量至高通量均可覆盖，适用于临床前研究和符合GMP的临床生产，并可在纳米颗粒表面添加标记物制造靶向药物。02锘海LS18平铺光片显微镜      锘海将携平铺光片显微镜产品资料和成像视频，向您展示生物组织透明化结合光片显微镜呈现快速高分辨率的生物组织三维成像案例，可广泛应用于神经科学、脑科学、胚胎发育学、肿瘤生物学、细胞生物学、药效评价和医学影像等领域。锘海诚挚邀请您参观我们的展位（B2），现场有锘海专业工程师与您探讨交流技术难点及实验步骤，欢迎各位老师莅临咨询！

2023年6月13日—6月15日，锘海生命科学继北京大学第三医院后又在北京大学医学部完成了新一台LS18平铺光片显微镜的装机培训工作。装机现场：理论培训&操作练习锘海工程师在仪器安装调试完成后，对用户进行详细培训：①LS18理论与操作讲解并进行实操培训。②数据处理与分析讲解。③协助用户拍摄样本及数据处理练习。培训反馈：培训结束后，用户对培训的结果感到满意，对培训期间的工作表示高度认可。锘海LS18平铺光片显微镜简介：锘海LS18光片显微镜是一款具有半自动校准能力的多功能平铺光片显微镜，它能够在同一成像视野大小下，快速平铺多个小而薄的光片（薄度可达1μm）进行分段照明。LS18平铺光片显微镜兼容所有组织透明化方法的样本，可进行多色快速3D成像。并且，结合组织膨胀技术分辨率可达到近70nm。

会议介绍作为mRNA与核酸领域规格最高的年度会议，MTDC 2023（第三届）mRNA药物开发峰会将于2023年7月5-6日在苏州召开。聚焦mRNA及核酸药物的临床申报与法规政策、mRNA药物设计与递送、mRNA药物生产与质控、mRNA技术创新与应用、小核酸药物工艺与生产、小核酸药物开发与递送、核酸药物非临床研究与DNA疫苗等热点话题，预计大会将吸引超过1000+观众，50+发言嘉宾参与。欢迎各位业内人士莅临锘海展位交流探讨！会议信息01会议时间2023年7月5日-6日02会议地点苏州阳光城希尔顿酒店03锘海生命科学展位A01展会核心产品01  铭汰微流控纳米药物递送平台       锘海将向您展示纳米药物制备系统及纳米药物制备、检测服务—从处方筛选到制剂表征全线过程。纳米药物制备系统通过微流控芯片技术制造纳米颗粒包裹体，可包裹化药、mRNA、siRNA、DNA等小分子物质，实现该物质的体内递送，从低通量至高通量均可覆盖，适用于临床前研究和符合GMP的临床生产，并可在纳米颗粒表面添加标记物制造靶向药物。02锘海LS18平铺光片显微镜      锘海将携平铺光片显微镜产品资料和成像视频，向您展示生物组织透明化结合光片显微镜呈现快速高分辨率的生物组织三维成像案例，可广泛应用于神经科学、脑科学、胚胎发育学、肿瘤生物学、细胞生物学、药效评价和医学影像等领域。锘海诚挚邀请您参观我们的展位（A01），现场有锘海专业工程师与您探讨交流技术难点及实验步骤，欢迎各位老师莅临咨询！

会议介绍6月29-30日，第九届中国生物医药创新合作大会暨华医榜2023中国生物医药产业价值榜颁奖盛典将于苏州金鸡湖凯宾斯基大酒店正式召开。此次大会获得众多机构支持，邀请200+行业专家，探讨不同的疗法进展（如：抗体药物、细胞治疗、基因治疗、RNA疗法等）、多种适应症考量（如肿瘤、CNS、自免与免疫疾病、眼科、罕见病等）、国际化视野（多中心临床、出海BD等）。欢迎各位业内人士莅临锘海展位交流探讨！会议信息01会议时间2023年6月29日-30日02会议地点苏州金鸡湖凯宾斯基大酒店03锘海生命科学展位A10展会核心产品01  铭汰微流控纳米药物递送平台       锘海将向您展示纳米药物制备系统及纳米药物制备、检测服务—从处方筛选到制剂表征全线过程。纳米药物制备系统通过微流控芯片技术制造纳米颗粒包裹体，可包裹化药、mRNA、siRNA、DNA等小分子物质，实现该物质的体内递送，从低通量至高通量均可覆盖，适用于临床前研究和符合GMP的临床生产，并可在纳米颗粒表面添加标记物制造靶向药物。02锘海LS18平铺光片显微镜      锘海将携平铺光片显微镜产品资料和成像视频，向您展示生物组织透明化结合光片显微镜呈现快速高分辨率的生物组织三维成像案例，可广泛应用于神经科学、脑科学、胚胎发育学、肿瘤生物学、细胞生物学、药效评价和医学影像等领域。锘海诚挚邀请您参观我们的展位（A10），现场有锘海专业工程师与您探讨交流技术难点及实验步骤，欢迎各位老师莅临咨询！

半月板是位于膝关节间隙的一对纤维软骨，可维持膝关节的稳定并分散承重压力，在人体多种运动场景均扮演重要的作用。由于血管分布较少，半月板的再生能力非常有限，在严重的损伤中，目前只能采取半月板的部分或全部切除手术。而长期来看，该治标不治本的方法仍会导致膝关节不稳定、继发软骨损伤等问题。最根本有效的方法，仍然是使用人工半月板进行替代，而生物3D打印就是构建人工半月板结构的有效手段。 构建具有各向异性的半月板结构半月板虽体积不大，其内外组成成分却并不相同。放射状和环状的胶原纤维使得整个半月板具有各向异性和压缩-拉伸非线性。目前，尽管已有许多报道成功打印出半月板结构，但在模拟其各向异性上仍为空白。因此Xavier等人使用regenHU生物3D打印机，成功构建出具有各向异性的半月板结构。为了引导细胞按照预定形状、方向进行生长，需构建细胞生长支架（Scaffold）。此前，作者已经证明了PCL构建的支架可作为边界，在喷墨打印出细胞后引导新生组织生长的方向。因此，在此次研究中，作者继续深化该方向，通过熔融沉积（FDM）和熔融静电书写（Melt electrowriting，MEW）两种打印方式，使用聚己内酯（Polycaprolactone，PCL）作为原材料分别构建不同纵横比（1:1、1:4、1:16）支架（图1），并维持每个支架微孔面积相等。除了打印出较为规则的单一纵横比支架，作者也尝试打印拼接多种纵横比的支架（图2），使最终细胞增殖形成的组织具有各向异性。图1 不同纵横比和打印方式获得的支架结构图2 具有多种纵横比的支架结构随后，将分散有已知浓度（3×107 cell/mL）骨髓源性间叶干细胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells，bMSCs）的生物墨水（含3% w/v氧化海藻酸盐）通过regenHU电磁阀喷墨打印头按照预先计算的细胞数量精准喷在由PCL构建的每一个支架微孔中（图3），继而加入45 mM CaCl2溶液进行交联。5 min后，置换为增殖培养基（Expansion medium，XPAN）；24 h后，置换为换软骨分化培养基（Chondrogenic differentiation medium，CDM）。最后置于5% pO2环境中，并进行随后的表征、测试。图3 喷墨打印头电磁阀开启时间与液滴体积、细胞数量之间的关系在结构强度测试中，作者首先对两种支架打印方式获得的软骨组织进行单轴压缩以测定其基本的机械性能。结果差距明显，使用熔融沉积获得的软骨组织弹性不足（图4），因而在后续的实验中，均为熔融静电书写方式获得的软骨组织。图4 两种支架打印方式得到的软骨压缩特性对比（绿色为人类半月板压缩模量范围）在后续测试中，作者发现支架纵横比（图5）对于组织强度具有非常显著的影响。尤其在屈服应力（Yield stress）和拉伸模量（Tensile Modulus）两个指标上，纵横比越大，在长轴上的数值越高，短轴方向上的数值则反而不如小纵横比（图6）。图5 支架纵横比示意图图6三种纵横比的拉伸模量、屈服应力和屈服应变 小结作者提供了一种通过改变支架纵横比，进而按需构建软骨力学性能的研究思路，结合熔融静电书写，可更为真实地构建体外组织。 参考文献[1] X. Barceló, K.F. Eichholz, I.F. Gonçalves et al. Acta Biomaterialia 158 (2023) 216–227.regenHU 生物3D打印机另可提供下列材料Demo服务• 水凝胶 • 低粘度液体 • 光固化材料 • 热塑性材料(聚合物)

前言在提升LNP-mRNA转染效力的问题上，多数研究者会采用两种方式：1.更换已公开的配方进行尝试；2.开发新的可电离脂质。从逻辑上讲，两种方式都没有问题，但如果对配方过程的优化更深一步，相信新的发现会指引我们更好的解决问题。下文将主要介绍LNP-mRNA合成时酸性缓冲液的变化带来的一系列影响。‍‍缓冲液类型和浓度的变化诱导泡状结构形成研究人员采用KC2脂质配方，具体组成为KC2/DSPC/胆固醇/PEG-DMG (50/10/38.5/1.5 mol%)，引入Dil或Dio（荧光染料适用于FRET分析）。在包裹mRNA时使用多种pH4缓冲液，分别为：25 mM NaOAc、300 mM NaOAc、300 mM CitPhos及300 mM Na-citrate，包裹完成后在pH 7.4的PBS中透析。 表1.使用不同pH 4缓冲液配制的LNP-mRNA体系平均粒径、PDI和包封效率对比表1中数据可知，酸性缓冲液的类型、浓度对所制备粒子的粒径、PDI及包封率均有影响。总体上看，粒子的直径与缓冲液浓度呈正相关关系，包封率则恰好相反。图1.高浓度pH 4缓冲液中合成的LNP-mRNA可诱导泡状结构的形成并提高体外转染效率当酸性缓冲液为25 mM的NaOAc时，仅观察到LNP-mRNA“实核”结构，未有明显泡状结构形成（如图1d）；而在300 mM NaOAc、CitPhos及Na-citrate的缓冲条件下，体系分别显示出LNP总面积5%、44%和59%的泡状结构（图1c、e、f、g）。用不同缓冲条件下制备的LNP-mRNA孵育Huh7细胞，24小时检测其发光强度。如图1b所示，在300 mM条件下制备的LNP-mRNA，其发光强度远高于在25 mM条件下制备的。由此推测，泡状结构的形成有利于增强mRNA的转染效果，但转染效果的增强不能归因于摄取的增加（图2，摄取量未增加）。图2.不同缓冲条件下制备的LNP-mRNA体外吸收对比可电离脂质的种类影响泡状结构的形成图3. 使用不同类型可电离脂质的表征结果研究人员选用了多种离子型脂质，通过低温透射电镜观察不同缓冲浓度下LNP-mRNA的形貌差异。选用的离子型脂质有MC3、ALC-0315和SM-102，缓冲液对比浓度为25 mM和300 mM。表2为LNP-mRNA的物理参数，在300 mM的缓冲条件下，MC3和ALC-0315组粒子的尺寸显著增加，且包封率有下降；而SM-102组的粒子尺寸和包封率都维持的非常好。观察图3a中的细胞孵育结果，相比于25 mM缓冲液，在300 mM条件下，三种脂质所对应的体系荧光强度分别增加了20倍、4倍和2倍（0.3 μg mRNA/mL）。统计电镜数据可得（图3d-i），泡状结构占比也从2%、4%和53%提升为76%、21%及更大结构的气泡。由此可见，缓冲液浓度的提升真实的提高了LNP-mRNA的转染效力，即使包封率有所下降，而可电离脂质的不同也会对泡状结构的水平产生影响。表2. 不同缓冲浓度下形成的LNP-mRNA粒径、PDI及包封率参数具有泡状结构的LNP-mRNA可提升小鼠体内转染水平接下来，研究人员针对KC2和SM-102所在的配方进行体内研究。以0.5 mg/kg的mRNA剂量静脉注射给CD-1小鼠，在注射后3、6、24小时检测生物发光。图4.LNP-mRNA小鼠体内表达图如图4所示，与25 mM NaOAc缓冲液相比，使用300 mM Na-citrate缓冲液制备的两种LNP-mRNA在肝脏和脾脏中的基因表达均显著提高，KC2相较于SM-102表现出了更优越的转染效力，且两者在注射后24小时仍可观察到荧光蛋白的表达。最后，研究人员进行了毒性测试。结果表明，在较高缓冲浓度下制备的LNP-mRNA没有引发更强的毒性。注射后24小时，两种（不同缓冲液浓度下制备）LNP-mRNA制剂的血液学、生物化学及细胞因子参数水平无显著差异（图5）。图5.LNP-mRNA有无泡状结构系统毒性无显著差异泡状结构可增强被封装mRNA的完整性图6.不同缓冲条件下mRNA完整性及翻译能力对比泡状结构的出现为何能显著提升LNP-mRNA的转染性能，针对此问题，研究人员进行了大量的论述，认为泡状结构的出现增强了被封装mRNA的完整性。此结论或许还需要更多的研究来进行证明，但图6、图7的数据也从某种程度上说明了这种结论的可靠性。300 mM的缓冲条件下，mRNA具有更强的翻译能力，且制成的LNP-mRNA在50% FBS中孵育一段时间后，显示出更好的mRNA完整性。总而言之，这些数据或推论，对于此领域的研究有着重要的指导推进作用。图7.mRNA完整性检测结论：通过对配方过程的深入优化，作者给予我们了一个重要结论，即酸性缓冲液的类型/浓度变化会大大影响LNP-mRNA的形貌及性能，这也为提升mRNA转染效力打开了一扇全新的大门，让研究者在关注可电离脂质开发之余，也关注mRNA的完整性及封装相关的重要参数，诸多考量，多向发力，定能加速此领域开发前进的步伐。

会议介绍“第五届上海国际癌症大会暨第四届中德双边论坛 & 第八届公济肿瘤论坛” 将于2023年06月16-18日（前沿创新篇）在上海召开。大会将设多个专题论坛，主题涉及肿瘤临床及转化、肿瘤免疫、肿瘤早筛、肿瘤综合诊治进展、肿瘤微环境、多组学、表观遗传及信号调控、类器官、肿瘤演进与分子功能可视化、新型肿瘤标记物与液体活检、肿瘤代谢、生物样本库、肿瘤药物研发、放射治疗、肿瘤创新、肿瘤微生态等肿瘤研究热点领域。会议信息01会议时间2023年6月16日-18日02会议地点上海好望角大饭店03锘海生命科学展位19展会核心产品01锘海LS18平铺光片显微镜      锘海将携平铺光片显微镜产品资料和成像视频，向您展示生物组织透明化结合光片显微镜呈现快速高分辨率的生物组织三维成像案例，可广泛应用于神经科学、脑科学、胚胎发育学、肿瘤生物学、细胞生物学、药效评价和医学影像等领域。023D成像一站式科研服务     锘海生命科学搭建了一站式服务平台，为广大客户提供专业的生物组织透明化、免疫染色、平铺光片显微镜3D荧光成像、数据分析、数据存储等一站式科研服务，旨在通过精细、快速、多样化的科研服务为每一位生命科学工作者提供个体化/定制化的解决方案。03生物组织透明化试剂盒（水性）该试剂盒主要是通过水化作用增加细胞膜流动性，结合去垢剂对细胞膜的通透作用实现对样品去脂的目的，并通过折射率匹配使样品透明。该方法适用于各种生物组织的透明化处理。 04生物组织膨胀试剂盒      利用水凝胶网络将生物大分子原位固定，并进一步实现各向同性的膨胀，从而达到提高组织分辨率的目的。05  铭汰微流控纳米药物递送平台       锘海将向您展示纳米药物制备系统及纳米药物制备、检测服务—从处方筛选到制剂表征全线过程。纳米药物制备系统通过微流控芯片技术制造纳米颗粒包裹体，可包裹化药、mRNA、siRNA、DNA等小分子物质，实现该物质的体内递送，从低通量至高通量均可覆盖，适用于临床前研究和符合GMP的临床生产，并可在纳米颗粒表面添加标记物制造靶向药物。锘海诚挚邀请您参观我们的展位（19），现场有锘海专业工程师与您探讨交流技术难点及实验步骤，欢迎各位老师莅临咨询！

研究背景：脑膜淋巴管将脑脊液中的大分子、废物和免疫细胞排入外周淋巴系统的颈淋巴结，在衰老、阿尔茨海默病、帕金森病及创伤性脑损伤等脑部病变中受到调节。然而，淋巴管是否也能延伸到脑实质深处，以及淋巴管是否能受到生活压力事件的调节，目前尚不清楚。2023年Nashat Abumaria和冯异老师团队在《Research》上发表题为“Characteristic Features of Deep Brain Lymphatic Vessels and Their Regulation by Chronic Stress”的研究文章，这项研究使用了组织透明化、免疫染色、全脑光片成像、脑厚切片共聚焦成像和流式细胞术证明脑深部淋巴管的存在并对其进行表征，并且研究了慢性压力如何影响这些淋巴管，为脑深部淋巴管的特征以及它们在压力生活事件中的调节提供了新的见解。◆ 技术路线 ◆01检测小鼠大脑深处的淋巴管利用组织透明化方法完成脑组织透明化及淋巴管标志物LYVE1的免疫染色，光片显微镜扫描后的三维重构结果显示在脑膜上检测到了LYVE1阳性信号，尤其是在上矢状窦周围(图1B)。光学切片显示，LYVE1信号也存在于大脑深处的皮层、小脑、海马、中脑和脑干中，类似于血管状结构，相比而言纹状体中几乎没有信号(图1C)。进一步通过1mm脑厚切片进行验证（透明化、免疫染色和共聚焦显微镜成像，图1D)，同样观察到LYVE1信号不仅在脑膜区域，而且在皮层、海马和中脑中也被检测到(图1E)。此外，还发现CD34(血管标志物)和LYVE1标记的血管样结构平行，但LYVE1标记的血管样结构，其分支不如血管广泛(图1F)，而且没有红细胞(图1G)；T细胞（CD3标记）存在于LYVE1标记的血管样结构中(图H)。此外，LYVE1信号与其他3种淋巴内皮细胞标记物共定位，包括podoplanin、血管内皮生长因子受体3 (VEGFR3)和转录因子PROX1 (图1 I-K)。这表明，功能淋巴管不仅可以在脑膜结构内检测到，而且可以在大脑深处检测到。图1 淋巴管存在于鼠脑深部02脑深部淋巴管的特征及分布对LYVE1信号最强、最广泛的大脑区域(皮层、嗅球、海马、中脑、脑干和小脑)进行三维重构，并利用IMARIS软件的Filament and Surface算法显示脑深部淋巴管在每个脑区的起源及其分支、方向和直径(Ø)来分析其淋巴管。结果发现这些脑区淋巴管的平均直径在5 ~ 14 μm之间(图A ~ L)，淋巴管分支较少。在不同的大脑区域中，嗅球、皮层、中脑背侧的淋巴管起源于脑膜内的淋巴管；在中脑深处，下丘脑腹侧的淋巴网络起源于大脑腹侧 (图G)。脑干淋巴管也发源于外表面，与硬脑膜垂直，在脑干中部深处(距外表面约450 μm，图H和图I)未检测到脑干淋巴网络。在小脑中，淋巴管是从小脑表面的淋巴网络生长出来的，延伸到小脑深处，并继续与表面平行(图J)。在海马体内，血管向背侧延伸，几乎覆盖了整个海马，在齿状回中观察到较低的网络密度(图2K)。在丘脑中与在皮层中观察到的非常相似(图2L)。图2 脑深部淋巴管的特征03慢性应激调节脑深部淋巴管为了研究脑深部淋巴管是否会受到外部环境因素的影响，作者将小鼠暴露于慢性不可预测的轻度压力下，并检查与精神/应激障碍有关的不同脑区脑深部淋巴管的变化。全脑成像和脑切片成像均显示：应激组小鼠海马全淋巴管、海马背侧淋巴管的长度和总面积减少，而淋巴管直径没有差异(图3A-J)。与海马结果相似，全脑成像显示慢性应激减少了丘脑淋巴管的长度和面积，但没有减少淋巴管的直径。在杏仁核中，慢性应激增加了淋巴管直径，但没有增加长度或面积(图3K至N)。为了进一步证明脑深部淋巴管的存在及其在不同应激条件下的调节作用，作者采用流式细胞术检测淋巴管标志物，发现在对照小鼠的海马和耳(作为阳性对照)中可以检测到淋巴内皮细胞的2种标记物LYVE1和podoplanin(图3O)。免疫组织化学和影像学研究显示慢性皮质酮(慢性应激动物模型替代)治疗降低了治疗小鼠海马中lyve1阳性细胞的百分比 (图3P)。综上，使用免疫组织化学、光片显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞术、多种淋巴管标志物(LYVE-1、podoplanin、VEGFR3和PROX1)，以及2种不同的应激样病理动物模型，证明淋巴管可以在脑组织深处检测到，而且以脑区域依赖的方式受到应激生活事件的调节。图3 慢性应激下调脑深部淋巴管04VEGF信号可能参与应激对脑深部淋巴管的调节慢性应激与炎症和免疫系统以及生长因子的变化有关。作者通过Western blot定量分析对照组和应激组小鼠海马中的炎症因子，发现破坏性炎症过程可能不是应激对海马深部脑淋巴管影响的主要因素（图A-D）。VEGF-C信号在淋巴内皮细胞增殖和淋巴管生成中起重要作用，它可通过与sVEGFR2的裂解和可溶形式结合而被中和并变得无效。作者定量了应激组和对照组小鼠海马中VEGF-C、VEGFR3、VEGFR2 及sVEGFR2的表达，发现慢性应激未导致VEGF-C表达变化，但VEGFR2和VEGFR3下调表达，sVEGFR2/VEGFR2比例增加(图4E-I)。进一步使用免疫共沉淀实验，发现VEGF-C可以与小鼠海马中的sVEGFR2相互作用（图J)，应激组小鼠海马裂解物中VEGF-C::sVEGFR2/ VEGF-C::VEGFR2比值增高(图K和I)，表明应激组小鼠海马中大部分VEGF-C被中和，无功能。综上，慢性应激可能通过两种方式降低海马淋巴管的VEGF-C信号活性：下调其受体的表达和减少VEGF-C可与其功能受体结合的数量。图4 慢性应激下调VEGF-C信号通路

会议介绍国际疫苗&生物技术4.0论坛(IVB4.0)是由 中国国际疫苗创新峰会(HVIS) 与 中国国际生物制药4.0峰会(CIBP4.0) 合并 组成的。IVB4.0旨在通过论坛与线上平台链接全球精英，消减信息互通成本，助力扶持生物医药领域初创企业并推动行业发展。IVB4.0 2023 将会由3天的峰会(IVB4.0论坛) 和疫苗生物技术创新展(Vaccine& Biotech Show)组成。IVB4.0论坛的演讲嘉宾及评委嘉宾将会在100人左右，目标参会参展人数会达到5000+。会议信息01会议时间2023年6月11日-13日02会议地点上海跨国采购会展中心03锘海生命科学展位F10展会核心产品01  铭汰微流控纳米药物递送平台       锘海将向您展示纳米药物制备系统及纳米药物制备、检测服务—从处方筛选到制剂表征全线过程。纳米药物制备系统通过微流控芯片技术制造纳米颗粒包裹体，可包裹化药、mRNA、siRNA、DNA等小分子物质，实现该物质的体内递送，从低通量至高通量均可覆盖，适用于临床前研究和符合GMP的临床生产，并可在纳米颗粒表面添加标记物制造靶向药物。

生物组织的三维成像极大推动了生命科学研究的发展。锘海生命科学与Thermo Fisher 达成合作共识，携手布局全球市场，共同为广大海内外科研工作者带来更为领先的生物组织研究产品矩阵。5月30日，Thermo Fisher Amira全球销售服务总监Oliver Faidi、亚太地区销售总监Barry Pearce、vds 部门总监Eric、生命科学全国销售经理郭栋一行来访锘海生命科学，双方就进一步促进在生物组织领域的全球化发展展开合作协商。赛默飞代表参观我司，了解LS18平铺光片显微镜在生物组织三维成像领域的优势及技术亮点。双方达成共识，结合LS18平铺光片显微镜业内顶尖的三维成像能力、卓越的组织透明化技术和赛默飞Amira强大功能一定会使得生物组织成像和数据分析表现更上一层楼。同时双方将联合各自优势构建全球领先的生物组织研究产品矩阵，共享销售渠道，共同开拓海内外生命科学研究和精准医疗市场，促进科技创新和产业升级。此次合作，将为双方带来更多的机遇和挑战。相信在双方的共同努力下，一定能够取得更加优异的成绩，为推动生命科学领域的发展做出更大的贡献。关于赛默飞赛默飞是一家全球领先的科学仪器和试剂供应商，帮助客户加速生命科学领域的研究，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。其图像处理软件Amira是一款功能强大的三维成像和数据分析软件，涉及细胞生物学、组织成像、神经科学、临床医学成像和生物工程等领域。关于锘海锘海专利平铺光片技术解决了传统光片显微镜中空间分辨率、光学层析能力和成像视野大小之间的矛盾，满足高通量、准确定位的荧光成像分析需求，广泛应用于脑科学、肿瘤学、药物研发、干细胞研究、组织胚胎学等各个领域。同时，搭建一站式科研服务平台，提供组织透明化、免疫荧光标记、高分辨大组织3D成像、图像分析与存储一站式服务，致力于为全球客户提供高质量的生物组织成像系统和科研服务。