好文分享：小鼠脊柱淋巴和血管网络三维可视化

随着生物医学的快速发展，越来越多的科学研究和临床应用，对生物组织高分辨率三维成像提出了新的需求，比如肿瘤微环境、神经投射、脉管系统等生命科学的研究，都需要生物组织完整的三维结构信息。由于生物组织不透明，传统对生物组织三维成像的方法，依赖于组织切片的方式来完成，但是这种方式操作繁琐，且成像通量低。因此，基于机械切片的技术方式越来越不能满足当下的研究现状，随着组织透明化技术和光片显微成像的结合，正式打开了三维结构可视化研究的大门。

案例分享：
以往研究脊柱淋巴网络的信息很少，因为这些精细的结构嵌入在椎体组织中，很难用传统的组织学观察。2019年发表在Nature communications一篇题为“Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice”的文章成功探究了小鼠脊柱淋巴网络的结构与功能。在文章中，作者首先通过对脊柱节段采用iDISCO+方法进行免疫染色及透明化，结合一定的脱钙处理，并利用光片荧光显微镜进行成像，发现脊柱椎管内有广泛而复杂的淋巴管系统。

原文Fig.2经PROX1抗体染色的透明化胸椎，展示脊柱淋巴管系统的模块化结构。

原文Fig.8 采用LYVE1（绿色）和CD45（紫色）抗体对透明化后的颈椎节段进行双标记，表明脊髓淋巴管与免疫细胞的相互作用。

原文Fig.S1透明化胸椎的淋巴和血管系统。a、b透明化的胸椎节段进行PROX1（白色）/LYVE1（红色）双染色以识别淋巴管。c-h用LYVE1（绿色）和Podocalyxin（紫色）双标记以识别血管。

总之，组织透明化及3D成像技术可通过保留脊柱解剖结构和脉管系统三维连续性来描述淋巴、血管系统。

透明化染色方法流程：

文章使用了Renier及其同事开发的一种透明化方案，该方案基于甲醇脱水，并称为对溶剂透明化的器官进行免疫标记的三维成像（iDISCO+， http://www.idisco.info ）。梯度增加的甲醇浓度会导致适度的组织收缩（约10%），以及组织的“透明度”增加：

1.       经过固定的样品分别在20、40、60、80、100% 甲醇/PBS中逐步脱水1h。

2.       然后将其在33%甲醇/66%二氯甲烷（DCM）的溶液中孵育过夜。

3.       用100%甲醇洗涤2 × 1 h后，样品用5% H₂O₂甲醇（1 vol 30% H₂O₂/5 vol甲醇）在4℃漂白过夜。

4.       漂白后，样品分别在80、60、40、20%甲醇、PBS中再水化1 h。

5.       为了透明化脊柱，文章中添加了一个使用莫尔斯溶液的脱钙步骤，在室温下孵育30分钟。使用莫尔斯溶液（1/1柠檬酸钠和45%甲酸）的弱酸处理可以有效地对组织脱钙，同时保留其结构。

6.       用PBS快速洗涤样品，然后在PTx2 （PBS/0.2% Triton X-100）中孵育2 × 1 h。在这一步后，对样本进行免疫染色处理。

7.       样本在PBS/0.2% Triton X-100/20% DMSO/0.3 M甘氨酸中，37℃孵育24 h。

8.       然后在PBS/0.2% Triton X-100/10% DMSO/6%驴血清中，37℃封闭24 h。

9.       样品在PTwH （PBS/0.2%吐温-20与10 mg/ml肝素）/5% DMSO/3%驴血清的一抗稀释液中，37℃孵育6天。

10.    样本在PTwH中洗涤5次直至次日。

11.    然后在PTwH/3%驴血清二抗体稀释中，37℃孵育4天。

12.    最后在PTwH中洗涤5次直至次日。

13.    然后将样本在33%/DCM 66%甲醇溶液中孵育过夜。

14.    随后在100% DCM中孵育2 × 15 min以洗涤甲醇。

15.    最后，样品在二苄醚（DBE）中孵育，直到透明化（约4 h），即可成像。

参考文献：

Jacob L, Boisserand LSB, Geraldo LHM, et al. Anatomy and function of the vertebral column lymphatic network in mice. Nat Commun. 2019;10(1):4594.

Renier N, et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 2014;159:896–910.

Morse A. Formic acid-sodium citrate decalcification and butyl alcohol dehydration of teeth and bones for sectioning in paraffin. J. Dent. Res. 1945;24:143–153.

Shibata Y, Fujita S, Takahashi H, Yamaguchi A, Koji T. Assessment of decalcifying protocols for detection of specific RNA by non-radioactive in situ hybridization in calcified tissues. Histochem. Cell Biol. 2000;113:153–159.

González-Chávez SA, Pacheco-Tena C, Macías-Vázquez CE, Luévano-Flores E. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2013;6:1972–1983.

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