扫描电镜（SEM）操作指南：如何获得高质量的图片

      如何评价SEM图片的质量？这是一个颇为复杂的问题，涉及到主观因素。SEM图的解读需要观察者根据自己的经验和知识进行分析和判断，其中观察者的主观偏见或期望可能会影响对图像的解读，比如刻意避开不理想的区域，选择局部OK区域来代表自己的预期。

如果忽略主观因素，那怎么才算一张高质量的SEM照片呢？

        从视觉感受出发：1.要具备高分辨能力，能够清晰地显示样品的细节和显微结构，边界锐利，不模糊。2.衬度适中，突出样品的特征，使不同部分易于区分。3.低噪声，具有足够的信噪比，实现图像细节的高清度（注意，这个和分辨率还不是一个概念，可以理解为单位像素点上束流密度变大了）。4.无失真，尤其是在低倍数下，保持样品的原始形状和比例，避免图像扭曲或变形，有助于进行准确的测量和分析。5.足够的景深，对于具有层次感的样品，譬如多孔材料或金属断口，需要使整个样品都能清晰成像，而不仅仅是表面。6. 要有代表性，能够准确地代表样品的整体特征，不是局部或异常的表现，这对于得出可靠的结论和进行比较研究很关键。7.准确的标注：包括哪种放大倍数，工作距离，探测器等必要的标注，使其他人能够理解图像的相关参数信息，有助于图像的交流和引用。8.符合研究目的：能够满足研究或分析的特定需求，与研究问题或目标相关，能为研究提供有价值的信息和证据。

图1 陶瓷过滤膜截面。低加速电压不镀金成像，可辨别支撑体上不同孔尺寸的3层过滤膜，膜层颗粒堆积的形态以及颗粒表面细节。图注：着陆电压500V，减速电压2KV，束流25pA,赛默飞Apreo2T1探测器。

图2 陶瓷过滤膜截面。低加速电压不镀金成像，可清楚的辨别支撑体上不同孔尺寸的2层氧化锆过滤膜，膜层颗粒堆积的形态。图注：5KV，束流50pA,赛默飞Apreo2 T1 探测器。

      有了以上SEM照片质量的评价标准，那么，对于电镜操作员来说，如何获得高质量的图片呢？

这也是一个比较复杂的问题，细分来说，可以从以下几个角度考虑：1.样品制备，2选择合适的仪器参数，比如加速电压，工作距离，束流大小等，3.聚焦和合轴，4.选择合适的探测器，5.选择合适的扫描速度，6图像的后期优化处理。

      总的来说，需要通过实践和经验积累，掌握如何调整参数和优化成像条件。同时注意观察图像中的细节和异常，及时调整参数以获得更好的结果。另外，作为初学者，需要与有经验的SEM操作人员、研究人员或工程师交流，从他们那里获得经验和技巧。也可以积极参加培训课程或研讨会，提高自己的技能水平。

      要获取高质量的图片，样品制备至关重要。处理不当的样品会导致观察假象，对于大多数样品的要求是，应干燥且导电，以获得效果。

首先因为观察的对象不同，有生物样品，也有材料样品，因此，并非所有SEM都使用相同的样品制备顺序。此外，SEM的具体步骤取也决于具体的设备类型，以下是一些常规的流程和注意事项，旨在简单阐述制备样品的过程。

图3 SEM样品制备的流程：干燥样品和含水样品。

     SEM中生物样品的制备步骤一般包括：1取材：选择合适的生物样本；2清洗：去除表面的杂质；3固定：使用化学试剂固定样本；4脱水：通过梯度脱水处理；5干燥：选择适当的干燥方法；6镀膜：通常使用金、铂等金属进行镀膜，增加导电性；7.观察：将制备好的样品放入SEM中进行观察。

在整个制备过程中，需要注意以下几点：尽量保持样本的原始结构和形态。控制每个步骤的条件，以确保样品的质量。避免污染和损伤样品。

1.1 生物样品：固定

     含水样品主要涉及到生物类样品，生物样品通常具有高含水量。如果样品未经特殊处理就放入SEM真空中，由于真空会将水从样品中抽出，样品结构可能会受到严重损坏，同时也会污染SEM样品仓。对于这类样品，简单的风干或加热干燥方法并不合适，因为在干燥过程中样品会发生变化(想想生活中，葡萄和葡萄干之间的区别)。

图4 葡萄与葡萄干，结构发生了明显的改变

      生物样品的制备步骤通常通常需要复杂且周期长，包括固定、脱水和干燥。一旦样品完全干燥，就可以将其安装在SEM样品上，然后镀膜或者不镀膜观察。

生物样品的制备流程主要涉及以下步骤：

      化学固定（Chemical fixation）：化学固定法是将样品浸入化学固定液中。通常使用的是含3%戊二醛在0.1M 缓冲溶液（如Sorrenson磷酸盐缓冲溶液），PH值取决于组织，植物组织通常使用6.8，动物组织通常使用 7.2-7.4。磷酸盐缓冲液无毒，戊二醛可交联蛋白质，使样品更坚硬。

组织一般在固定液中浸泡1-2小时（取决于样品大小），温度为4℃，有时也可在室温下浸泡。然而，用于SEM的样品可在固定液中存放数周而不会明显降解。使用带有散热片的 BioWave 微波炉可加快固定过程。

一次固定后通常会用缓冲液清洗，然后进行第二次化学固定，以稳定部分脂质成分（脂肪酸）。在室温下（在通风橱内！），将1%的四氧化锇溶于缓冲液（如 0.1M 的可可碱缓冲液）中1到2小时。

对于只关注外部结构的SEM来说，较大的组织块通常不需要长时间固定，因为内部固定不佳并不那么重要。固定后，样品需要在乙醇中逐级脱水，然后通过临界点干燥（CPD）或冷冻方法干燥。

      备注：在 SEM 生物样品制备的梯度脱水过程中，常用的乙醇或丙酮浓度依次为：30%乙醇或丙酮：浸泡一段时间。50%乙醇或丙酮：再浸泡一段时间。70%乙醇或丙酮：继续浸泡。90%乙醇或丙酮：浸泡一定时间。100%乙醇或丙酮：脱水。

具体的浓度参数可能因生物样品的类型、大小和特性而有所不同。

      蒸汽固定（Vapour fixation）：不是所有的样品都适合化学固定，有些样品就很容易损坏，因此不可能浸入液体中。这对于真菌及其子实体(分生孢子)来说尤其如此，它们在接触时会从母体植物中分离出来。

蒸汽固定使用一滴固定剂，放在密封容器中靠近样品的地方。在切下的受感染的叶片材料的情况下，用4%的四氧化锇水溶液，在大约1小时内固定样品。样品固定后会变黑，这有助于评估进度。一旦固定，样品可以放在用液氮冷却的金属块上冷冻，然后冷冻干燥。

冷冻固定（Cryofixation）：快速冷冻含有液体或水的样品会使液体变成固体，而不会形成很多晶体。有许多冷冻样品的装置。高压冷冻的技术，可以产生的形态，但是它们需要极小的样品量（非常适用于TEM）。对于SEM来说，将样品放入液氮流体或液氮泥浆中通常就足够了，或者可以将在SEM样品仓中通过冷台来冷冻样品。

      一旦冷冻，样品就可以很容易地观察样品的原始形貌，这也可以避免切割软材料造成的损坏。通常需要在冷冻样品上镀上一层金属观察。冷冻样品可以在冷冻状态下保存很长时间，这个流程涉及到的安全问题包括冻伤和氮气窒息。

1.1 生物样品：干燥

      冷冻干燥（freeze drying）：冷冻干燥通过蒸发除去样品中的冷冻水，也就是说，水分子没有先转化为水就从冰中消失了，这个过程很慢，但如果做得好，通常可以让样品保持完好和完全干燥。优点是避免了危险的化学固定剂。

样品一般放在大型预冷金属块的凹陷处，一旦进入冷冻干燥室，就打开真空，让机器在零下30度左右运行3天左右。

需要注意的是，因为干燥后样品的重量比比较轻，所以在干燥过程结束时，必须小心将空气引入室内，否则样品会被风吹走而丢失。

        临界点干燥（Critical point drying，CPD）：样品中的水逐渐被乙醇取代，乙醇随后被液态二氧化碳取代。然后增加容器的压力和温度，直到CO2达到临界点，从液相变成气相。这样可以避免风干过程中造成的损坏，从而保护样品结构。

       化学干燥（Chemical-drying）：CPD的替代方法是使用六甲基二硅烷或HMDS，没有水的挤压表面张力，甚至没有乙醇蒸发造成的损害。

溶剂(优选乙醇)中的样品可以作为50:50的溶液引入HMDS，然后变成100% HMDS (2次变化)。更换时，可以将溶液排干，直到刚好盖住样品，然后放在通风柜中蒸发。对于非常小的样品，这可能需要几分钟的时间，对于较大的样品，这可能需要几天的时间。

对于不适合CPD室的大样品，或者载玻片/硅片上的样品，这是CPD的有用替代方法。然而，并非所有来自HMDS的样品都能成功干燥。此外，为了安全起见，不要吸入HMDS蒸汽，也不要将任何混有乙醇的溶液储存在封闭的瓶中，因为蒸汽压力会增加并导致爆炸。

此外，高分子聚合物样品可以是湿的，也可以是干的。如果它们是湿的(或含有大量的水或液体),则需要在SEM检测之前进行干燥。高分子聚合物材料通常不需要进行固定，但必须清除其中的液体。凝胶类多孔高分子聚合物样品，通常采用冷冻干燥，一旦样品完全干燥，就可以将其安装在样品台上，然后镀膜或不镀膜观察。

1.2 材料样品的表面观察

图5 不同材料的样品制备方法：观察表面

1.3 材料样品的截面观察

图6 不同材料的断面制备方法：观察断面

        我们关注材料的信息，通常是关注样品的表面或内部细节，因此以上也针对不同材料的表面和断面制备进行了简单的总结，这里就不再对各工艺细节进行详细的阐述。后续也会有专题对样品制备进行就行详尽的讨论。

        制备好的SEM样品附着在样品台上，这也是制备样品的一个非常重要的部分。因为SEM是一种表面成像技术，感兴趣的样品部分必须朝上，对于块状样品，样品表面和样品台底座之间必须有连续的通路（通常会用导电胶或导电浆料架起导电桥梁，再镀导电膜），这样电荷就不会积聚。

图7  尽量让块体或大颗粒粉末状样品跟金属衬底保持导电通路

      要使用SEM，必须首先将样品放入样品室。由于样品室保持真空，必须将干燥的空气或氮气引入样品室，以便打开样品室并将样品放在载物台上。尽量不要让样品仓门开太久，如果腔室没有保持在真空下，抽气时间会增加，并且长期这样操作，污染会在腔室内慢慢积聚。

       为什么要调整仪器参数？首先，优化图像质量，通过调整参数，可以获得更清晰、更详细的图像。其次，适应样本特性，不同的样本可能需要不同的参数设置。第三，提高分辨率，以更好地分辨样本的微观结构。第四，控制电子束强度，避免对样本造成过度损伤。第五，调整衬度，增强图像的衬度，便于观察。第六，优化景深使整个样本都能清晰成像。第七，适应不同的放大倍数，确保在不同放大倍数下都能获得良好的图像。

2.1 加速电压

       理论上，加速电压的增加将使SEM图像中的信号更多、噪声更低。但实际情况并非如此简单。高加速电压成像有一些缺点: 1. 高加速电压可穿透较厚的样品，但在SE模式下，对样品表面结构细节的分辨能力降低，低加速电压则适用于表面成像；2绝缘样品中的电子堆积增加，造成更严重的充电效应；3 在样品中传导的热量会增加，可能导致样品损伤，尤其是对热敏感的材料。

加速电压越高，电子束穿透力越强，相互作用体积越大，背散射电子（BSE）的数量也会增加。对于典型电压（如15KV）下的二次电子（SE）成像，BSE会进入二次电子探测器，并降低分辨率，因为它们来自样品的更深处。

图8 不同加速电压下，电子束与样品的相互作用体积不一样，高加速电压穿透的更深

      加速电压是灯丝和阳极之间的电压差，主要用于加速电子束向阳极移动。典型SEM的加速电压范围为1KV至30KV。电压越高，电子束穿透样品的能力就越强。

图9 不同加速电压带来的成像效果差异。1KV加速电压下，呈现更多的表面细节。赛默飞Apreo2 T1 探测器。

        下表中提供了选择加速电压的一般操作指南。当然，不同的电镜设备，即使参数相同，成像效果也会有差异，要确定样品成像的设置，需要进行实践操作。

    图10 加速电压选择的一般操作指南。对于电子束敏感材料以及需要观察样品极表面细节的样品，通常需要更低的电压和更低的束流。

2.2 光阑

       光阑是金属条上的一个小孔，它被放置在电子束的路径上，以限制电子沿镜筒向下运动。光阑可阻止偏离轴线或能量不足的电子沿柱子向下运动。根据所选光阑的大小，它还可以缩小光阑下方的电子束。

图11 物镜光阑对电子束路径的影响示意图

物镜 (OL) 光阑：该光阑用于减少或排除外来（散射）电子。操作员应选择的光阑，以获得高分辨率的SE图像。

图12 机械臂上有一个细金属条，上面有不同大小的孔，这些孔与较大的孔对齐，该金属条被称为光阑条。孔直径从20微米到1000微米不等

       大光阑可用于低倍成像以增加信号，也可用BSE成像和EDS分析工作。小光阑用于高分辨率工作和更好的景深，但缺点是到达样品的电子较少，因此图像亮度和信噪比较低。

      下表列出了一些光阑大小和实际用途的例子。不同光阑可使用数字刻度。例如，可以使用1、2、3和4。根据仪器的不同，可以用的数字表示的光阑直径，也可以用的数字表示小的光阑。

       在SEM设备校准过程中，为了生成良好的图像，需要检查光阑，以确保其围绕光束轴居中，这可以通过使用晃动（Wobbler）控制来实现。如果发现图像左右移动，则需要在 X 或 Y方向（进出或左右移动）调整光阑，调整时只需微微旋转相应的旋钮，直到图像停止移动为止。当电子束直径在样品表面达到小值时，聚焦效果好。图像应清晰明确。

2.3 束斑尺寸

       电子束锥在样品表面形成的束斑大小（横截面直径）会影响：1）图像的分辨率；2）产生的电子数量，从而影响图像的信噪比和清晰度。在低倍放大时，我们使用的束斑尺寸要比高倍放大时大。

图13 不同束斑大小对图像分辨率的影响

       当在相同的放大倍率、电压和工作距离下使用不同的束斑尺寸拍摄图像时，很容易看出不同系列图像在模糊度（分辨率）上的差异。表达束斑大小的方式取决于所用电镜的厂家和型号。

       下图是在三种不同束斑尺寸下拍摄的硅藻。在束斑尺寸（束斑5）下，图像显示的细节少于小束斑尺寸（束斑1）。不过，在小束斑尺寸下，图像的信噪比有所降低。

图14 三种不同束斑尺寸下拍摄的硅藻

      束斑尺寸会随着一些参数的改变而改变。例如，长工作距离（WD）下的束斑尺寸比短WD的大。物镜光阑越小，束斑尺寸越小。此外，无论使用哪种 WD，聚光透镜流过的电流越大（激励强，聚焦效果好），样品上的束斑就越小。

因此，当WD较小、聚光透镜激励较高、光阑较小时，我们就能实现小的束斑尺寸。这三个参数是相互影响的，需要仔细权衡，才能获得图像，因为它们还会影响其他参数，如焦距和电子信号强度。

2.4 工作距离（WD）：分辨率与景深

      样品工作距离 (WD) 是指SEM镜筒极靴底部与样品顶部之间的距离。在样品室中，样品台可以上升到更靠近极靴的一端（工作距离短），也可以下降到更低的位置（工作距离长）。

图15 工作距离（WD）示意图

      工作距离越短，样品表面的电子束直径就越小。因此，在可能的情况下，工作距离应保持在10毫米或更小，以获得高分辨率成像。但小工作距离的缺点是，会大大降低景深。虽然可以通过使用较小的物镜光阑来抵消这种不利因素，但同时也带来电子束流密度的降低（图像看起来颗粒感更强，不够细腻）。

备注：对于ET探测器来说，缩短WD带来高分辨率的效果是不够显著的。对于大部分镜筒内电子探测器，缩短WD能显著提高分辨率。这也是我们经常看到，高倍数的照片都是在短WD下拍摄的，极端情况下，WD可以＜1mm。

      在许多 SEM 中，外部工作距离 (Z) 控制杆可用于升高或降低试样，该值通常被误认为是准确的工作距离。然而，真正的工作距离 (WD)是以电子方式测量的，即样品表面聚焦点到极靴下表面的距离。外部Z控制（机械控制）值与图像屏幕上提供的 WD 值不同有三个原因。

只有当电子束准确聚焦到试样表面时，"屏幕上"的 WD 值才是准确的测量值。聚焦不足或聚焦过度的图像会提供虚假的WD值以及模糊的图像。

外部Z值和准确聚焦试样的真实 WD 值会有所不同，因为这两个测量值可能是从试样架上的不同点测量的。试样如果不是均匀平整的，不同的形貌特征会有不同的真实WD。

       WD会影响SEM图像的景深和分辨率。随着WD的增加，电子束发散角会减小，从而提供更大的景深。增加WD的"代价"是，电子束必须从扫描移动更远的距离，因此在试样上的束斑尺寸更大。

        景深是指试样在肉眼看来可接受的聚焦垂直范围。在SEM中，图像景深的 "范围 "通常比光学显微镜大上百倍，因此许多SEM显微照片几乎都是三维的。

图16 不同工作距离带来的景深效果不一样，WD越大，景深越好

2.5 图像的衬度和亮度

       SEM图像是根据从样品材料中射出的电子数来构建的强度图（数字或模拟）。SEM中每个驻留点的电子信号以像素的形式在屏幕上逐行显示，从而形成图像。每个点的信号强度反映了从形貌或成分中产生的电子多少。通过信号处理，每个电子的信号信息（从光束的每个驻留点获得）都可以在显示之前被转换成与原始值有严格关系的新值。这样，我们就可以通过调整信号来改变图像的衬度和亮度。

      在大多数情况下，未经处理的图像包含足够的"自然衬度"，操作员可以从图像中提取有用的信息。自然衬度可被视为直接来自样品和探测器系统的信号中包含的衬度。如果自然衬度过低或过高，则可能会丢失与重要细节相对应的信号变化。

在这种情况下，我们会看到图像中有很多黑色或白色区域。质量好的图像具有灰度渐变，只有极少部分是全黑或全白的。信号处理技术可以处理自然衬度，使眼睛可以通过图像中的衬度感知信息。虽然信号处理技术允许用户对自然衬度进行处理，但并没有增加信息，只是增强了已有的信息（因此，这种图像处理技术不属于对已有信息的篡改）。

       以下这幅图像左侧衬度太低，右侧衬度太高，中间的图像衬度是合适的。左边的图像可以后期调整，方法是在Photoshop软件中修改灰度 "色阶"的分布，但右图像无法修正，因为是纯黑白区域的（无法从这些区域获取更多数据）。

图17 图像衬度对比

       应该注意的是，信号处理会极大地改变图像的外观，使其与通常预期的不同，因此SEM操作员有义务说明是否进行了处理。不过，通常情况下，使用衬度和亮度旋钮调整图像质量是被认可的图像处理流程。但是，如果为了使SEM图像看起来更清晰而进行了一些其他处理，则应在正式报告中说明具体的处理的方式。

旧型号的SEM一般都需要手动调整衬度和亮度。更现代的机器则依靠软件程序自动调节，辅以机器操作员的喜好：一键操作，提高工作效率。但需要注意的是，人眼对图像衬度和亮度的感知或审美，往往和软件计算的结果并不一致，因为为了更好的图片质感，还需要依赖手动调节。

倾斜样品可以增加SE衬度：增加SE衬度的另一种方法是倾斜样品，使其与探头成一定角度（通常为 30° 至 60°）。倾斜的结果是，每单位投影试样面积会产生更多的 SE，从而使亮部和暗部的分布更加明显，从而增强衬度。

2.6 放大和校准

      放大是指放大图像或图像的一部分。在SEM中，放大是通过扫描较小的区域来实现的。在图像中，样品上的电子束用箭头表示。

      当扫描到一个较小的区域时，我们看到的是物体变大了。以下的显微图像的放大倍数从 900倍到 10000 倍不等。

图18 随着扫描区域的不同，放大倍数也会随之改变

        图像的放大倍数通常会在屏幕上给出一个数值（如2000x）。图像上还会有一个刻度条，代表精确的距离单位。

         在扫描电镜中，通常涉及到两个倍数，一个是底片倍数，一个是显示倍数。底片倍数，指扫描电镜获取图像时，实际拍摄到5英寸底片上的放大倍数。显示倍数是指在显示器上显示的放大倍数。初学者搞不清楚底片倍数和显示倍数的区别，同样的细节长度，显示倍数通常会比底片倍数高2-3倍，因此，衡量物体尺寸的大小看标尺刻度，而不是放大倍数。

       SEM的基本维护包括定期检查放大倍率的校准。在标准条件下对标准样品（如光栅网格）进行成像。对图像上的特征进行测量，并与给定的放大倍率或刻度条进行比较，以确保达到正确的尺寸。如果不正确，可以遵循校准程序。

在标准条件下，屏幕上显示的放大倍数可能包含2-5%的误差。在许多情况下，这种不确定性是可以接受的。但是，如果所做的工作需要很高的精确度（尤其是半导体行业的精确测量），则必须使用与实验条件完全相同的条件和校准标准来校准系统，校准标准的特征应与您希望在实验中测量的特征的尺寸密切匹配。例如，如果需要测量直径为 500nm 的颗粒大小，校准样品应包含相同大小的特征。

2.7 扫描速率和信噪比

        如果需要采集高质量的图像，以供日后使用或出版时，通常会降低扫描速率。较慢的扫描速率可以在电子束扫描线上的每个像素点收集到更多的电子。这样可以生成质量更好的图像。

        SEM的图像质量受束斑大小和信噪比的限制。信噪比是电子束产生的信号（S）与仪器电子设备在显示该信号时产生的噪声（N）之比（S/N）。噪声脉冲来源于电子束亮度、聚光透镜设置（束斑尺寸）和 SE 探测器灵敏度，可能会给图像带来类似颗粒感。当SEM参数设置为高分辨率成像时，其信噪比通常较低，因此会出现颗粒感，这可能是不可避免的。随着每个图像点记录的电子总数的增加，SEM的图像质量和信噪比也会随之提高。

图19 左图随着信噪比的增加，图像质量也会提高

        钨（W）灯丝的特点是亮度低，导致成像的电子束流密度低。因此，在聚光透镜设置为高分辨率成像时（小束斑尺寸），到达试样的电子数量较少。因此，SE 产量低，为了生成高质量的图像，必须使用大束流，这就弥补了信噪比的不足，但同时也带来了分辨率的下降。为了克服 W 灯丝的亮度限制并提高信噪比，人们开发了场发射枪 (FEG) 等明亮相干光源。

2.8 图像的假象：像散/边缘效应/充电效应/电子束损伤和污染

       要获得的图像，需要基础理论知识和实践，并且需要在许多因素之间进行权衡。这个过程可能会遇到一些棘手的问题。

像散

      像散是图像中难精确校正的调整之一，需要多加练习。下图中间的图像是经过像散校正的正确聚焦图像。左图和右图是像散校正不佳的例子，表现为图像出现拉伸的条纹。

      为实现精确成像，电子束（探针）到达试样时的横截面应为圆形。探针的横截面可能会扭曲，形成椭圆形。这是由一系列因素造成的，如加工精度和磁极片的材料、铁磁体铸造中的缺陷或铜绕组。这种变形称为像散，会导致聚焦困难。

      严重的像散可表现为图像中X方向的"条纹"，当图像从对焦不足到对焦过度时，条纹会转变为 Y 方向。在精确对焦时，条纹会消失，如果束斑大小合适，就能正确对焦。

图20 像散示意图，完全消除像散的图片如中间所示

       为了使探针呈圆形，需要使用像散校正器。这包括以四边形、六边形或八边形方向放置在镜筒周围的电磁线圈。这些线圈可以调整电子束的形状，并可用于校正任何重大的透镜变形。

       在放大 10,000 倍左右的情况下，将物镜调整到欠焦或过焦时，如果图像在一个方向或另一个方向上没有条纹，则一般认为图像没有像散。在1000倍以下的图像中，像散通常可以忽略不计。

       校正像散的方法是将X和Y像散器设置为零偏移（即不进行像散校正），然后尽可能精细地对焦样品。然后调整X 或Y消像散器控制（不能同时调整）以获得图像，并重新对焦。

边缘效应

图21 边缘效应产生示意图

            电子在样品中聚集并不受控制地放电会产生充电现象，这会产生不必要的假象，尤其是在二次电子图像中。当入射电子数大于从样品中逸出的电子数时，电子束击中样品的位置就会产生负电荷。这种现象被称为"充电Charging"，会导致一系列异常效果，如衬度异常、图像变形和偏移。有时，带电区域的电子突然放电会导致屏幕上出现明亮的闪光，这样就无法捕捉到衬度均匀的样品图像，甚至会导致小样品从样品台上脱落。

        充电效应的程度与 (1) 电子的能量和 (2) 电子的数量有关。电子的能量与加速电压有关，因此降低加速电压可以减少充电。电子的数量与许多参数有关，包括束流、电子枪的种类、束斑大小以及电子枪和试样之间的光阑。因此，通过调整这些参数来减少电子数也可以减少充电效应。

图22 横向的亮暗带是充电的结果

        要解决不导电样品的充电问题，在样品制备方法上是在样品上镀上一层较厚的金或铂薄膜，这样做是为了提高表面的导电性，使足够的电子能够逸出，避免表面充电和损坏。颗粒等松散材料经常会受到充电的影响，在实际操作上，这些样品都通过磁控溅射镀膜仪来镀上一层厚3-10nm的金属层。

图23 锂电池干法隔膜。上图，不镀膜，即使在500V低电压下，T2探测器成像存在明显的充电效应，隔膜形态无法辨别。下图，镀膜后，可以很好的缓解充电效应，用T2能拍清楚隔膜表面细节轮廓和孔隙的大小，插图为AFM图，可以证实，溅射的过程并没有对隔膜造成损伤，保持了较真实的结构细节。

图24 锂电池隔膜。除了镀膜处理，采用Apreo2的T1探测器可以直接对隔膜成像，相比镀膜后的效果，表面细节可以辨别，但还不够清晰。

此外，在相同的电镜参数条件下，比如都是低加速电压成像，合理的选择探测器，也有助于缓解荷电效应。从上面的隔膜样品就能看出来，同样的参数T2和T1探测器，对充电效应的敏感程度是不一样的。

图25 树脂溶液中的橡胶纳米粒子，不镀金。即使选择Apreo2电镜的T2探测器在1KV下成像，但依旧存在充电效应。切换到T1探测器，不仅能避免充电效应，还能准确测量出溶液中的纳米颗粒尺寸。

       此外，除了低加速电压成像，具有低真空功能的SEM或环境SEM (ESEM) 可用于控制充电效应。

用电子束辐照试样会导致电子束能量以热量的形式流失到试样中。较高的加速电压会导致辐照点的温度升高，这可能会损坏（如熔化）聚合物或蛋白质等易碎试样，并蒸发蜡或其他试样成分，同时也会污染镜筒。

       解决办法是降低电子束能量，增加工作距离也有帮助，因为在相同的电子束能量下，可以在样品上产生更大的束斑，但这样做的缺点是会降低分辨率。

与电子束相关的污染是指在电子束扫描过的样品区域沉积材料（如碳），这是电子束与真空室中的气态分子（如碳氢化合物）相互作用的结果。

图26 采用等离子清洗，消除样品表面污染和假象

       总之，获得满意的SEM图片需要综合考虑样品制备、仪器设置和图像处理等方面的因素。在样品制备过程中，需要选择合适的样品、清洗方法和干燥方法。在仪器参数设置过程中，需要选择合适的加速电压、工作距离和探测器类型等。在图像处理过程中，需要选择合适的图像增强、信号过滤方法。此外，还要考虑像散/边缘效应/充电效应/电子束损伤和污染的因素。

通过综合考虑并权衡这些因素，可以获得高质量的SEM图像，从而提高对材料的分析和理解水平。