培养细胞的生物学特性

培养细胞的生物学特性

一、体外培养细胞的分型

体外培养细胞时，主要有两种培养体系：一种是贴附依赖型，一种是悬浮型。

• 贴附依赖型

大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖型细胞，依据培养细胞在体外的形态大致可将其分为以下四种类型：

1. 上皮细胞型

细胞多呈扁平不规则多角形，中央有圆形细胞核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。此型细胞多起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等。例如，来源于人类胚肾的HEK293细胞，来源于人类肝脏组织的HEPG2细胞，来源于人类子宫颈的Hela细胞就属此类。

1. 成纤维细胞型

胞体多呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形细胞核，呈放射状生长。除真正的成纤维细胞外，起源于中胚层间充质的组织的心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等均呈本型形态。另外，也常将一些与成纤维细胞形态类似的培养细胞归为此类。常见的成纤维性细胞如源自小鼠胚胎的NIH 3T3、小鼠结缔组织的L929、中国仓鼠卵巢的CHO、叙利亚地鼠肾脏的BHK-21等。

1. 游走细胞型 细胞实验技术论坛 http://bbs.bbioo.com/forum-138-1.html

多呈散在生长，一般不连成片，具有活跃的游走或变形运动能力，且方向不确定。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞进行严格区别。

1. 多型细胞型

一些细胞，如神经细胞由于难以确定其稳定的形态，常归于此类。

 图2-1  A：来自小鼠胚胎的成纤维细胞型NIH 3T3细胞；B：来自兔肝的上皮细胞型CL-9细胞。

（二）悬浮型

有一些类型的细胞在体外培养时不需要贴附，而是悬浮生长。这些细胞的胞体常呈圆形，多见于一些造血系肿瘤细胞，其特点是生长速度较快、传代方便。常见的U937 、HL60、K562造血系肿瘤细胞均属此类。

二、体外培养细胞与体内细胞的差异

细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间相互作用的影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，体外培养的正常细胞已成为一种在特定条件下生长的细胞群体。它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也出现了一些不同于机体细胞的性状，主要表现在：（1）失去原有组织结构和细胞形态。如，体外培养的肌肉细胞表现出纤维化的特点。（2）分化减弱或不显，出现类似“返祖”现象（去分化），细胞的形态功能趋向单一化，或在生存一定时间后衰退死亡。（3）发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系，或变成具有恶性性状的细胞群。

三、培养细胞的生长特点

• 贴附

大多数哺乳动物细胞在体外生长时需附着在一定底物如塑料、胶原、玻璃或其他细胞做成的饲养层细胞上才能生长、分裂。贴附之前的细胞一般为球体样，在一些特殊的能促进细胞贴附的物质如III型胶原、血清扩展因子的帮助下，细胞先吸附到底物上，随后与底物附着并伸展成一定的形状。

    不同细胞的贴附能力不同，如巨噬细胞、成纤维细胞等的贴附能力较强，能在数分钟至数十分钟内贴附到固相表面；而神经元细胞、羊水细胞等的贴附能力则较弱，一般需要数小时乃至更长的时间才能贴附到固相表面。

• 接触抑制与密度依赖性

对于相当一部分体外培养的贴附细胞来说，随着细胞不断的生长与分裂，当相邻两个细胞彼此靠近时，其中之一或两个细胞便会停止移动而不至于重叠起来，转而朝向未生长有细胞的空间生长，这种现象被称为接触抑制（contact inhibition）。而进一步的生长会使细胞密度变得越来越大直至形成一个细胞单层，在此过程中，细胞与培养基接触的面积也会因此而减少，此时，细胞的分裂便会停止，但细胞还会存活一段时间，这种现象被称为密度抑制（density inhibition）或密度依赖性。通常，细胞的这种密度依赖性与培养基中血清的浓度关系密切。

于体外培养的正常细胞不同，转化细胞或恶变的肿瘤细胞的接触抑制特性降低或丧失，导致细胞重叠生长。同时，转化细胞或恶变的肿瘤细胞的密度依赖性调节也常常降低，对血清的依赖性也降低，可以生长到一个较高的终末细胞密度。

四、体外培养细胞的生长过程 

体外生长的培养细胞受营养条件、生长空间等因素的限制，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液进行扩大培养，此过程称传代（subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。加之很多细胞特别是正常细胞，其在体外的生存也不是无限的过程，这就使得细胞在体外培养时的生长过程与体内有着一系列不同的生存特点。

（一）培养细胞的生命期（life span of culture cells）

    所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本一致。体外培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况密切相关。比如，来源自人胚的二倍体成纤维细胞可在体外连续传代30-50代，约150-300个细胞增殖周期，相当于一年左右的生存时间。相比之下，那些来自成体或衰老个体的细胞的生存时间则较短，如体外培养的肝细胞或肾细胞一般仅能传几代或十几代。

通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段：

1．原代培养期

原代培养也称初代培养，是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。

2．传代期   

传代期通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系（cell line）。一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。

3．衰退期

处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。

上文所述特点，主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性（immortality）或恶型性（malignancy）的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系（infinite cell line），或连续细胞系（continuous cell line）。

• 培养细胞的一代生存期

所谓培养细胞的“一代生存期”，是指从细胞接种后到再次传代培养之前的这一段时间，它与细胞世代（generation）或倍增（doubling）时间不同。例如，某一细胞系为第60代细胞，即指该细胞系已传代了60次。就培养细胞的一代生存期而言，细胞通常可以倍增3-6次。

培养细胞的一代生存期，一般可被分为以下三个阶段：

1．潜伏期（latent phase）

    以贴壁生长的培养细胞为例，刚刚经历传代接种的细胞，常在培养基中呈现悬浮状态，此时细胞的细胞质回缩，胞体呈圆球形。紧接着，悬浮细胞便会贴附于底物表面上，此过程称贴壁。各种细胞贴附速度并不相同，这与培养细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。通常，原代培养细胞贴附慢，可长达10-24小时或更多；而连续细胞系和恶性细胞系的贴壁过程则较快快，只需10-30分钟即可贴附。待细胞贴附于支持物后，细胞便开始进一步伸展成极性细胞，但这距离细胞进入生长和增殖期还有一定时间，称为潜伏期。细胞潜伏期的长短与细胞接种密度、细胞种类以及培养基性质等密切相关。通常，原代培养细胞的潜伏期较长，约需24-96小时或更长时间，而连续细胞系和肿瘤细胞的潜伏期则较短，仅6-24小时。另外，细胞接种密度大时潜伏期常会变短。

2．对数生长期（logarithmic growth phase）

当细胞分裂相开始出现并逐渐增多，便标志着潜伏期的结束和对数生长期的开始。对数生长期是细胞增殖分裂最旺盛的阶段。对数生长期细胞分裂相数量的多少常作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志，一般用分裂指数（mitotic index，MI）来表示：分裂相在整个细胞群中所占的百分比。体外培养细胞的分裂指数受细胞种类、培养液成分、营养条件、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数多介于0.1%-0.5%之间，原代细胞分裂指数较低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%-5%。对数增生期是细胞一代生存期中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。

3．停滞期（stagnate phase）

当细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（plateau phase）。处于此期的细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，但随着培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物的积累、pH值的降低，此时需要进行及时的传代培养，否则细胞会因营养匮乏、中毒等原因，发生形态改变，重则从底物脱落死亡。