1.酶标板酶标板是一种配在酶标仪上做酶联免疫实验用的板子，常用的为96孔，主要是为了配合酶标仪所设计，另外还有48孔的，但不常用。在酶联免疫实验中，抗原、抗体和其它生物分子通过多种机制吸附至酶标板表面，然后于受检样本和酶标抗原或抗体按不同的步骤进行反应，通过酶标仪来进行检测。2.培养板培养板是用来培养细胞或者细菌的，有6孔、12孔、24孔、48孔、96孔之分。和透明的酶标板样子差不多，但是用途却相差很大。在培养板的孔中加入适量的培养液，然后在适合的环境下进行细胞培养。一般的培养板都是平底的，适合细胞和组织的悬浮培养，另外还有U型底和V型底。在经过了表面改性处理之后，可以使其具有细胞贴壁培养和生长性能。3.pcr板PCR板是配在PCR仪里面用的,和酶标板配合酶标仪用一样，就是作为一个固相载体，让样品在其中进行pcr反应，然后利用PCR仪进行检测。其实简单的说，PCR板就是许多PCR管的组合，一般为96孔。4.深孔板像酶标板、PCR板等可以成为微孔板，因为每个孔的容积很小，实验室中还有一种板子，其孔比较深，一般底部为U底的，采用高分子材料制成，具有良好的化学兼容性，可使用于大多数极性有机溶液、酸性和碱性溶液等实验室液体的贮存。5.血清板采用透明的高分子聚苯乙烯材料制成，表面经过特殊处理，主要是用于血清稀释、蛋白和抗原抗体浓度测定用的。

在众多实验缓冲液中，HBSS显得有点默默无名。HBSS主要用于培养液的配制或清洗细胞，不能单独使用。本文介绍HBSS的配制和使用方法。 HBSS，即汉克斯平衡盐。英文全名Hank's Balanced Salt Solution。D-Hank's与Hank's的一个主要区别在于前者不含有钙和镁离子，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Hank平衡盐溶液( HBSS)的配方为：8 g/L NaCl， 0.4 g/L KCl， 1 g/L 葡萄糖， 60 mg/L KH2PO4， 47.5 mg/L Na2HPO4， 调pH至7.2.一般用于配制细胞培养过程中的培养基或者清洗细胞。 Hank's配方:NaCl 8.01;KCl 0.4;CaCl2 0.14;NaHCO3 0.35;KH2PO4 0.06;Glucose 0.34(g/l); Hank平衡盐溶液( HBSS)的配方为：8 g/L NaCl， 0.4 g/L KCl， 1 g/L 葡萄糖， 60 mg/L KH2PO4， 47.5 mg/L Na2HPO4， 调pH至7.2. HBSS一共分为四种，含钙镁，含酚红;含钙镁，不含酚红;不含钙镁，含酚红(D-hanks );不含钙镁，不含酚红(D-Hanks)。此四种产品可根据客户需要自己选择。而如果客户无法判断应该选择哪一种，可以选不含钙镁，不含酚红(D-Hanks )。 　 Hanks’含钙镁含酚红 Hanks’含钙镁，不含酚红 D- Hanks’不含钙镁含酚红 D- Hanks’不含钙镁不含酚红 DPBS不含钙镁不含酚红 PBS不含钙镁不含酚红 10*PBS不含钙镁不含酚红　 g/L g/L g/L g/L g/L g/L g/LNaCl 8 8 8 8 8 8 80Na2HPO.12H2O 0.126 0.126 0.126 0.126 2.9 2.9 29NaH2PO4·2H2O 0 0 0 0 0 0 0KCl 0.4 0.4 0.4 0.4 0.2 0.2 2KH2PO4 0.06 0.06 0.06 0.06 0.2 0.24 2.4MgSO4 0.098 0.098 0 0 0 0 0CaCl2 0.14 0.14 0 0 0 0 0D-葡萄糖 1 1 1 1 0 0 0酚红 0.01 0 0.01 0 0 0 0添加NaHCO3 0.35 0.35 0.35 0.35 0 0 0那么，HBSS能高压灭菌吗? 答案是否定的。因为HBSS溶液里面含有1g/L的葡萄糖和碳酸氢根，高压会发生反应引起变性。通常大家都是过滤灭菌的。如果用量小，可以直接订购现成的。如果用量大，自己弄一套过滤的设备过滤也简单。

细胞培养是实验室里最常见和最基本的实验了，但却不是最简单的。别小看细胞培养，这里可蕴含着大学问。有时候细胞状态不好，转染、药筛这些实验根本就没办法做。影响细胞培养的因素很多，让我们先从培养基和血清说起。经典的培养基有很多种，Invitrogen(GIBCO)、thermo fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。◆MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的，其中增加了组分的范围及浓度。◆Dulbecco改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的，现在常用于贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍，维生素浓度是MEM的4倍，采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L，后来为了某些细胞的生长需要，将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L，这就是大家常说的低糖和高糖了。◆aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸，它可广泛应用于各种细胞类型，包括对营养成分要求苛刻的细胞。◆Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的，现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用，得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物，这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。◆RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的，现在已广泛应用于悬浮细胞的培养。以前经常听到有人问，这种细胞该用哪一种培养基呢?其实这个问题的答案可以很简单，也可以好复杂。此话怎讲?如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库，那很简单，问供应商就行了。或者找到相关的文献，作为参考。Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具，也很好用。选择你感兴趣的细胞类型，它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等，有时还有优化好的转染步骤，很方便。Sigma网站上也有一个Media Expert，包括了培养基所有成分的功能描述、使用推介和参考文献等，它还是一个解决问题能手，对于细胞培养中的常见问题，如细胞贴壁不好、培养基变色等，它都会列出可能的原因，并提供补救办法。这个Expert果然不简单!但如果你是着手建立一种全新细胞的培养体系，根本找不到任何参考，那你就得花点时间自己试验了。万事开头难嘛。因为没有一个标准答案。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做贴壁细胞培养、RPMI 1640做悬浮细胞培养会是一个好的开始。你也可以购买几种培养基来，然后花大约两周的时间做一个简单的细胞生长实验，来选择其中最适合的。有时候你会惊讶地发现你的最佳培养条件与文献报道的不同，就算是同一种培养条件，细胞的生长状态也时好时坏，这是很正常的。因为试剂、水、不同批号的血清之间都存在着差异。要提高培养基的稳定性，可以从培养基和血清两方面入手。以前大部分实验室都是用干粉培养基，但配制过程就较为繁琐，要溶解、调pH值，过滤，过程中可能会产生一些浓度误差，而且有些实验室的水质并不理想，所以培养的效果会有差异。如果使用液体培养基，这种人为的误差会减少，因为毕竟是大批量工业化生产的，批间差会很小。大家是不是感觉液体培养基会贵很多，以前是这样，但现在非也。HyClone和Invitrogen都在国内建立了液体培养基的生产基地，生产和运输成本大幅降低，所以现在的价格也只是50-60元/500ml，比干粉培养基贵不了多少，而且还帮你省了过滤器和时间。血清含有生长因子可促进细胞的繁殖，含有附着因子可促进细胞的贴壁，同时还具有抗胰酶活性。血清同时也是矿物质、脂类及激素的来源。最常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清和马血清等。牛血清是按照采血时间的早晚来分类的。采血时间越早，营养物质越丰富，所含抗体也越少，因而胎牛血清适合要求高的细胞系和克隆化培养。由于疯牛病的原因，到目前为止，我国政府仍然禁止从北美洲、欧洲和日本等地区进口牛血清，因此市面上的牛血清大多来自澳洲、南美洲，或是国产的。而血清批次间的差别就是不可避免的，这种差异来源于不同的制备方法和除菌方法、动物的年龄差别及血清的储存条件等，而且与取血动物的来源关系密切。不同的牧场、不同的气候天气及其他环境因素都可能影响血清的质量。因此选好了一种血清就要尽可能长期使用它。在需要更换时，也要尽量保持与原有的一批血清相似。现在很多公司都提供血清预留，你一旦选定了某个批次的血清，最好备足一年的量，这样可以避免很多麻烦。血清固然是细胞培养中不可或缺的成分，但正如上文所说，血清的批间差异大，更换血清时需要做大量的测试以取保替换的血清与原来的相似。而血清的供应也是必须要考虑的因素。由于气候或疯牛病的影响，说不定哪天血清就突然没得卖了，那对实验的影响可非同小可。另外，血清的价格也很昂贵，虽说现在也有便宜的国产血清，但是高品质的澳洲血清价格仍旧高企。因此，也有一些实验室开始换用无血清培养基。无血清培养基(Serum-Free Media)，通常以SFM表示，顾名思义，就是在细胞培养中不需要添加血清，但是在某些应用中可能要添加生长因子或细胞因子。无血清培养基中添加了血清的主要成分：粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等，能减少上述血清带来的不利因素，使细胞培养的条件更稳定。但它也不是完美的，从有血清培养过渡到无血清培养的条件并不像想象中那么直截了当。处于发育的不同分化阶段的细胞(例如干细胞与定向前体细胞相比)需要不同的配方，对生长因子和细胞因子的选择尤为重要。而且在去除血清的同时，也去除了一些血清蛋白具有的保护、解毒作用，因此对试剂、水的纯度和仪器清洁度的要求更高。另外，它的价格也比普通的培养基贵很多。现在有很多厂家生产无血清培养基。GIBCO这个细胞培养的金字招牌当然少不了，它也是最早研制无血清培养基的。目前已经开发了ES细胞、杂交瘤、CHO、293、昆虫细胞、神经细胞、淋巴细胞、角质细胞、内皮细胞等多种细胞的无血清培养基。上个月还推出了首个间充质干细胞的无血清培养基，能使MSC维持未分化状态超过9代。HyClone公司也有CHO、293、杂交瘤细胞、昆虫细胞、病毒疫苗细胞的多种无血清培养基。Sigma则刚刚收购了澳大利亚JRH公司，有了JRH的EX-CELL系列，无血清培养基的选择也更多了。这么多种，要选择起来也是个头疼的事情。除了部分培养基是公开配方的，如用于培养内皮细胞的MCDB 131(Sigma)，大部分液体培养基都是专利配方的，也就是说其中的成分是保密的。那么你只能是检索文献、让供应商推荐，然后用自己的细胞做几次传代培养来选出最合适的培养基。毕竟实践出真知嘛。P.S.附上一些细胞培养中的小Tip，可能会对您有所启发。(部分摘自Invitrogen的中文Focus)?切记，细胞培养基的储存条件是2-8摄氏度。如果细胞培养基不小心被冻，您应该融化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。?贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，可能在放置几天后颜色变紫。这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的pH值(确定松开瓶口以保证气体交换)。?当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。?一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。?总之，大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。?血清的热灭活在免疫分析时可以灭活补体系统。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。热灭活是以往公认的操作步骤，并没有确凿的证据说明这样做是有益的。相反，对大部分细胞而言，GIBCO和HyClone都不推荐热灭活血清。因为加热可能使血清中的沉淀增加，使您误以为污染。?如何避免血清中沉淀物的产生?1.解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。并随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。2.请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。3.血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。4.若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。?在进行传代培养时，我们强烈推荐进行台盼兰活性记数。研究者常常通过一个简单的稀释(1∶4或1∶2)进行传代，不进行活性检测，您可能接种比你认为的低的多的浓度的细胞，这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长。?贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液只能使用一周。胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。?在订购的细胞到达后，应立即复苏，如果培养基还没有准备好，可将其放入液氮中，尽快复苏。千万不能放置在-20或-80℃的冰箱内。?细胞复苏往往是比较容易出问题的步骤。请在订购细胞时就向供应商索取详细的复苏步骤，并仔细阅读。有些供应商就不推荐在复苏时离心，对此类细节，应特别留意。

1、哪种浓度的酒精消毒效果最好?75%酒精杀菌力最强，它能使蛋白质脱水和变性，在3～5分钟内杀死细菌。因此，它用于消毒和防腐，适用于皮肤和器械、塑料制品等的消毒。高浓度的酒精(95～100%)能引起菌体表层蛋白质凝固，形成保护层，使酒精分子不易透入，因此杀菌能力反而弱。2、试剂的等级有哪些?根据化学试剂的纯度，按杂质含量的多少可分为四级：一级试剂为优质纯试剂，通常用G·R表示;二级试剂为分析纯试剂，通常用A·R表示;三级试剂为化学纯试剂，通常用C·R表示;四级试剂为实验或工业试剂，通常用L·R表示。此外，根据特殊的工作目的，还有一些特殊的纯度标准，例如光谱纯、荧光纯、半导体纯等。使用时应按不同的实验要求，选用不同规格的试剂。3、固体试剂的溶解知多少?较大的固体颗粒溶解前，应该先粉碎固体。固体的粉碎是在洗净和干燥的研钵中进行的。研钵中所盛固体的量不要超过研钵总容量的三分之一。溶解固体时，常用搅拌，加热等方法来加快溶解速度。搅拌液体应手持搅拌棒并转动手腕，转动速度不要太快，也不要使搅拌棒碰在器壁上。搅拌试管中的液体时，搅拌棒可以转动，也可轻轻上下搅动，但不要用力过大，以免将试管弄破。还可用振荡试管的方法代替搅拌。加热以加速固体溶解的方法与加热液体时相同，即一般有直接加热方法和水浴加热方法等。要视被加热物质的稳定性，而选用不同的加热方法。另外还要注意在容器上盖表面皿，以防止液体蒸发。4、下面这些你注意了吗?称量试剂的天平应保持清洁、干燥，避免潮湿及腐蚀性气体的侵蚀。在进行称量操作时，被称取的试剂应置于称量纸上或其它器皿内，不可在盘中直接称量。在配制强酸、强碱溶液或接触有毒性药物时，应严格按操作规程进行。如稀释硫酸时，应谨慎的将浓硫酸缓缓倾注水中，切不可把水倒入浓硫酸中。在配制药物溶液时，某种动物注入药液的最大容量决定所配药物溶液的浓度。如静脉注射药液容量过大，可影响其循环系统的正常功能。故静脉注射容量最好在体重的1/100以下;静脉外(皮下、肌肉及腹腔)注射容量最好在体重的1/40以下;因此，可根据动物的体重，选择所配药物溶液的适当浓度。在配制药物溶液时，应考虑到实验动物内环境的稳定性以及动物离体器官或组织在实验条件下的正常功能。应力求达到与血液及体液呈等渗与等张以及等pH值和离子平衡状态，应使用生理盐水配制(温血动物用0.9%NaCl，冷血动物用0.6%NaCl)。离体器官灌流液或营养液因用量大，应严格计算渗透压、pH值与各种离子浓度，有时还要考虑营养成分如葡萄糖的含量等，根据动物离体器官的不同而使用不同的生理溶液。

MO BIO Laboratories公司近日推出了NoviPure?土壤蛋白提取试剂盒，其要成分是两种专利的缓冲液SP1和SP2，可从土壤中高效提取蛋白质。土壤中生存着大量的微生物，包括细菌、真菌、放线菌、病毒和原生生物等。据估计，1 g土壤中有4,000～7,000种细菌，数量近10亿个。然而，土壤环境比较复杂，又富含腐殖酸等干扰物质，这使得无论是核酸还是蛋白的提取都颇为困难。为此，MO BIO Laboratories公司近日推出了NoviPure?土壤蛋白提取试剂盒，这是市场上第一款能够从各种土壤类型中提取蛋白的试剂盒。MO BIO作为土壤、粪便以及其他复杂样本处理的专家，20年来一直关注这一特殊领域。NoviPure?土壤蛋白提取试剂盒中的主要成分是两种专利的缓冲液SP1和SP2。首先利用玻璃珠和陶瓷珠的混合物来高效裂解细胞，同时增溶胞内和胞外的蛋白质。这一技术避免了干扰物质(如腐殖酸)的同时纯化，产生了蛋白沉淀。此沉淀可重悬在任何缓冲液中，用于保存或下游分析。与传统方法相比，蛋白的杂质更少，产量更高。据介绍，经这一试剂盒提取出蛋白已成功用于1D和2D凝胶电泳以及质谱(2D LC-MS/MS)。为了保护珍贵的样本，试剂盒中的所有试剂和消耗品都不含蛋白酶。对于研究土壤中微生物含量和确定特定活性的研究人员而言，可靠的土壤蛋白提取很重要。蛋白的分离和鉴定是确定细胞功能所必需的，这实现了微生物与特定功能的关联研究。除了蛋白提取试剂盒，MO BIO还提供了一系列土壤DNA和rna提取试剂盒。其Power系列产品利用专利的抑制剂去除技术(IRT)，能够从即使是最困难的土壤类型中去除腐植酸和土壤中的褐色物质，为下游成功的PCR分析助上一臂之力。后续的PCR分析适合多种生物的检测，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌、藻类，放线菌类以及线虫类等。Power系列产品有多种规格可供选择，其中有一些适合自动化的核酸提取系统，如epMotion和KingFisher。

在蛋白质定量试验中，最常用的方法是BCA法蛋白定量。那么为什么我们要选择用BCA法?而且常常使用到bca蛋白定量试剂盒（BCA Protein Assay Kit）。因为BCA法蛋白定量具有很多优点，如1.实验操作十分简单方便;2.实验耗时短，快速;3.试剂灵敏度高，实验结果准确;4.所用的试剂稳定性好，而且经济实用，抗干扰能力强等。实验原理：BCA(bicinchoninic acid)法蛋白浓度定量：在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+(biuret reaction)。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。产品特点1.步骤简单，45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。2.灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。3.BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20, 60, 80。4.在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。5. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。实验步骤：1. 先将solutionA 摇晃混匀，根据样品数量，按50体积solution A加1体积solutionB试剂(50:1)配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液在24小时内稳定。2.稀释标准品：完全溶解蛋白质标准品(5mg/mlBSA,-20℃保存)取10微升用PBS稀释至100微升(样品一般可用PBS稀释)，使终浓度为 0.5mg/ml。将稀释后的标准品(0.5mg/ml)按0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20微升分別加到96孔板的蛋白标准品孔中，加标准品稀释液补足到20微升。3.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液不足道20ul。即：将蛋白质样品作适当稀释(最好多做几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释。4.在 各孔中加入200微升BCA工作液，这时使用加样枪轻柔吹打，将其中液体混匀，这时请注意，尽量小一点力气轻柔一点，不要弄出很多气泡，这样会影响读数)，然后再37℃室内放置30-60min。将液体冷却至室温，在酶标仪上测定A562nm，或540-590nm之间的波长的吸光值，最后可根据标准曲线计算出蛋白质的浓度，为样品蛋白质定量。

山羊布鲁氏菌病(Brucellosis)ELISA试剂盒注意事项：1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。4． 如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值） ，请先将样本稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请最后乘以稀释倍数（×5×n） 。5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6．本试剂不同批号组分不得混用。显色剂 B 请避光保存。7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

上海心语生物有限公司人转铁蛋白受体(TFR)ELISA试剂盒等一系列elisa试剂盒提供免费代测，快速检测一周内出结果，各种指标齐全，数据报告权威、公正、真实。开学季，相关ELISA试剂盒优惠热销中：英文名:Human B-Lymphocyte Chemoattractant 1,BLC-1 ELISA Kit 人B-淋巴细胞趋化因子1(BLC-1/CXCL13)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human connective tissue-activating peptide Ⅲ,CTAPⅢ ELISA Kit 人结缔组织活化肽Ⅲ(CTAPⅢ)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor,M-CSFR ELISA Kit 人巨噬细胞集落刺激因子受体(M-CSFR)ELISA Kit ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human Receptor Ⅰ for the Fc region of immunoglobulin A,FcαRⅠ ELISA Kit 人免疫球蛋白A Fc段受体Ⅰ(FcαRⅠ/CD89)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human Receptor Ⅱ for the Fc region of immunoglobulin E,FcεRⅡ ELISA Kit 人免疫球蛋白E Fc段受体Ⅱ(FcεRⅡ/CD23)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human Receptor Ⅲ for the Fc region of immunoglobulin G,FcγRⅢ ELISA Kit 人免疫球蛋白G Fc段受体Ⅲ(FcγRⅢ/CD16)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human Receptor Ⅱ for the Fc region of immunoglobulin G,FcγRⅡ ELISA Kit 人免疫球蛋白G Fc段受体Ⅱ(FcγRⅡ/CD32)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human Receptor Ⅰ for the Fc region of immunoglobulin G,FcγRⅠ ELISA Kit 人免疫球蛋白G Fc段受体Ⅰ(FcγRⅠ/CD64)ELISA Kit G Fc段受体Ⅰ(FcγRⅠ/CD64)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human Receptor Ⅲ for the Fc region of immunoglobulin G,FcγRⅢ ELISA Kit 人免疫球蛋白G Fc段受体Ⅲ(FcγRⅢ/CD16)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human Receptor Ⅱ for the Fc region of immunoglobulin G,FcγRⅡ ELISA Kit 人免疫球蛋白G Fc段受体Ⅱ(FcγRⅡ/CD32)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human ReceptorⅠfor the Fc region of immunoglobulin G,FcγRⅠ ELISA Kit  人免疫球蛋白G Fc段受体Ⅰ(FcγRⅠ/CD64)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human granulocyte chemotactic protein-2,GCP-2 ELISA KIT  人粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2/CXCL6)ELISA Kit ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human Interferon ω,IFN-ω ELISA Kit 人ω干扰素(IFN-ω)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human glycosylation-dependent cell adhesion molecule-1,GlyCAM-1 ELISA Kit 人糖基化依赖的细胞黏附分子(GlyCAM-1)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human interferon Regulatory Factor,IRF ELISA Kit 人干扰素调节因子(IRF)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human lymphotoxinβ,LTB ELISA Kit 人淋巴毒素β(LTB)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human lymphotoxinα,LTA ELISA Kit 人淋巴毒素α(LTA)ELISA Kit  ELISA.  规格：96T/48T英文名:Human CC-chemokine receptor 1,CCR1 ELISA Kit 人CC趋化因子受体1(CCR1)ELISA Kit ELISA.  规格：96T/48T

（一）材料及试剂 1．猪瘟单抗纯化抗原 2．兔抗猪IgG酶标抗体 3．猪瘟阳性血清 4．猪瘟阴性血清 1～4均由指定的生物制品所购买。 5．elisa反应板 6．包被液 碳酸钠 1.50g 碳酸氢钠 2.93g H2O加至 1 000ml pH值9.6 7．PBS液 氯化钠 8.90g 磷酸二氢钾 0.20g 无水磷酸氢二钠 2.13g 加双馏水 1 000ml 8．PBS－吐温洗涤液 PBS液 1 000ml 犊牛血清 5ml 混合即可 9．底物溶液 ⑴ 0.1Mol/L柠檬酸液 柠檬酸 21g 双蒸馏水加至 1 000ml ⑵ 0.2Mol/L Na2HPO4液 Na2HPO4·12H2O 71.6g 双蒸馏水 加至 1 000ml ⑶ pH5.0磷酸盐－柠檬酸缓冲液 取⑴液 24.30ml ⑵液 25.70ml 混匀即可 ⑷邻苯二胺液 取⑶液 50ml 双馏水 50ml 磷苯二胺 20mg 30%H2O2 0.15ml 待邻苯二胺溶化后再加H2O2，现用现配。 10．终止液 浓H2SO4(98%) 22.2ml H2O 177.80ml （二）操作方法 1．用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各做100倍稀释，每孔包被100μl，4℃湿盒过夜。 2．次日取出，甩去孔内液体，3×3′冲洗。 3．将待检血清以PBS液做400倍稀释，每孔加100μl同时将猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清各做100倍稀释，于对照孔中加100μl。37℃温育1.5h～2h。 4．重复第二步，取出，甩去孔内液体，3×3′洗涤。 5．将兔抗猪IgG酶标抗体以PBS液做100倍稀释，每孔加100μl，37℃温育1.5h～2h。 6．重复第4步。 7．每孔加底物溶液100μl，室温下观察显色反应。当阴性对照孔稍显色时，立即终止反应，并以阴性孔做空白对照。 8．每孔加终止液50μl立即于酶联免疫吸附检测仪测定490nm波长的光密度。 （三）结果判定 在猪瘟弱毒酶联板上，OD≥0.2，为猪瘟弱毒抗体阳性；OD＜0.2，为猪瘟弱毒抗体阴性。 在猪瘟强毒酶联板上，OD≥0.5，为猪瘟强毒抗体阳性；OD＜0.2，为猪瘟强毒抗体阴性。

elisa实验的原理似乎很简单，不外乎固定抗原，添加一抗、二抗和底物，间中夹杂着洗涤和封闭。然而，即使是平淡无奇的洗涤和封闭，如果做得不太好，也有可能毁了整个实验。在实验结束时，我们是否能获得有意义的信息，这在很大程度上取决于结果的信噪比。背景噪音会影响您对结果的判断。如何降低ELISA的背景，下面有一些tips。一、洗涤很重要洗涤步骤看似很无聊，其实很重要，因为如果未结合的材料(如非特异结合的抗体或检测试剂)残留在微孔板中，那么它会增加背景噪音。如有必要，可增加洗涤液中的盐浓度，这会阻止非特异结合反应。如果背景过高，而您怀疑洗涤不够时，可以尝试增加洗涤次数。二、封闭更关键封闭液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点。这就降低了可产生信号的抗体非特异结合的机会。您当然也希望抗体只与目的蛋白结合吧。如果您的背景过高，怀疑封闭不充分，那么您可以尝试使用更高浓度的封闭液，或适当延长封闭时间。如果您一直被背景问题所困扰，那么也许您该花些时间来优化封闭液。这可能需要时间，但也是值得的。目前主要有两种类型的封闭液：蛋白和非离子型去污剂。您使用的类型须取决于多个因素，包括微孔板的表面试剂、吸附的抗原、您的抗体和检测试剂。好的封闭液应降低非特异性结合，但它不应当与抗原、抗体或检测试剂发生相互作用。最常用的非离子型去污剂是Tween-20。这种封闭液便宜、稳定，在去除洗涤过程中的一些非特异结合上很有用。但它们只在存在时起作用，因为很容易被洗掉。因此所有洗涤液中也必须添加封闭液。请勿使用高浓度(正常浓度为0.01-0.1%)，它会降低特异结合，产生假阴性。另一个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封闭液，后者可协助洗涤过程中的封闭。蛋白封闭液则有所不同，是永久的。它们与开放位点结合并封闭，同时稳定与微孔板结合的抗原分子。常用的蛋白封闭液包括牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、正常血清和鱼明胶。血清组分的内在多样性可使它有效拦截许多不同类型的分子相互作用。不过，它的缺点在于能与Protein A和IgG抗体相互作用。解决这个问题的一种方法是使用鸡或鱼的正常血清。三、抗体浓度须优化我们通常会follow师兄师姐留下来的操作步骤，但是如果试剂稍有不同，则可能需要优化抗体的量。记住，非特异的抗体结合会增加背景。为了防止这一点，切勿使用过多的一抗或二抗。四、检测试剂要适量另一点也很显而易见：切勿使用过多的检测试剂。如果浓度过高，或者未正确稀释，则会导致高背景。也不要显色过度，如有必要，优化一下何时应加入终止液。如果您的ELISA不幸地遇到了高背景，那么也无需太担心，依次查看ELISA系统中的组分，并排除可能存在的问题。悉心优化，相信很快就会有漂亮的结果。

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1.观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。2.加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。3.打开超净台(先开风机，后开照明)，用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。4.取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。5.取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。6.用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。(加versene主要是为了将旧培养基洗去)。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。7.打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。8.将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。9.取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后(细胞变圆，但不漂起)，用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。10.吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。11.细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。12.擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。13.吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。

elisa实验原理酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)原理1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度类型及步骤ELISA的主要常用类型及步骤1. 间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(二抗)以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：1)将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。2)加稀释的样本，保温反应。样本中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，样本中的其他成份在洗涤过程中被洗去。3)加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与样本中受检抗体的量正相关。4)加底物显色。4.竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。ELISA Q&A如何选择合适的阳性对照?阳性对照的基本组成应该尽量与检测样本的组成一致，一般阳性对照多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，加入一定量的待检物质。比如，以人血清为标本的测定，阳性对照多用确定的病人血清或者以复钙人血浆为原料加入一定量标准品。如何选择合适的阴性对照?阴性对照的基本组成也应该尽量与检测样本的组成一致，最好先行检测确定其中不含待检物质。比如，检测人血清标本时，阴性对照应该选择正常人血清;检测免疫动物血清中抗体效价时，阴性对照应该选择该动物的免疫前血清。如何选择最优化的包被条件?1.包被抗原的选择包被抗原可分为天然蛋白、重组蛋白和小分子抗原三大类。天然蛋白需经纯化才能用直接吸附法包被，对于含杂质较多的抗原可以采用间接捕获法包被(先用能够与目的抗原反应的物质如抗体直接吸附在酶标板上，再通过特异性反应使抗原固相化)。经纯化的重组蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有机化合物，由于分子量太小，往往难于直接吸附在酶标板上，一般都先使其与无关蛋白质如BSA等偶联，偶联物吸附于固相载体上。2.包被液的选择一般常用的是pH9.6的碳酸盐缓冲液，如果包被的抗原在碱性条件下不稳定的话，也可以使用pH7.2的磷酸盐缓冲液。3.包被温度的选择通常是4-8度条件下过夜或者37度保温2小时，我们强烈建议4-8度条件下包被，有利于蛋白活性的保持。4.包被浓度的选择包被的最适浓度随固相载体和包被物的性质变化，一般蛋白质的包被浓度为1-5ug/ml，要明确针对特定包被抗原的最适包被浓度需要通过实验来确定。包板后需要封闭吗?应该选择什么样的封闭体系?封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。而在间接法测定中，封闭一般是必不可少的。常用的封闭剂有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明胶、5%的脱脂奶粉，AbMART推荐使用5%脱脂奶粉，价廉而且封闭能力强，不过5%脱脂奶粉只适合短期内使用，不宜长期保存，所以试剂盒中较少使用。如何正确使用酶结合物?1.酶结合物的稀释液在稀释液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如1%BSA或5%脱脂奶粉)，通过竞争抑制酶结合物在固相载体上的非特异性吸附。一般还加入能够抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20(0.05%的浓度较为适宜)。2.正确稀释酶结合物酶结合物的合适工作浓度需要通过预实验来确定，浓度过高易导致本底偏高，浓度过低则会导致阳性信号的减弱。酶结合物最好在使用前稀释，稀释后的酶结合物不宜长期保存，因为低浓度的酶结合物极易失活。问题   可能的原因   解决方法   阴性对照产生了阳性的结果   试剂或者耗材污染   更换试剂，使用一次性耗材   洗板出现问题   更换更强配方的洗涤液，增加洗板次数，延长洗板时间   如果是在双抗体夹心法中出现，有可能是包被抗体与二抗间有交叉反应   更换包被抗体或二抗   使用了过多的抗体   减少抗体使用量   整板出现高背景   二抗产生了非特异性吸附   减少二抗使用量，缩短二抗反应时间   显色液不新鲜   使用现配的显色液   显色反应时间过长没有终止   控制显色反应时间，及时终止反应   试剂或者耗材污染   更换试剂，使用一次性耗材   反应温度过高导致的非特异性吸附   严格控制反应在最适温度下进行   封闭条件不佳导致的非特异性吸附   更换封闭能力更强的封闭液，延长封闭时间   反应信号偏低   包被条件不合适   提高包板浓度，延长包板时间   抗原抗体反应不够充分   延长反应时间，确保反应在最适温度下进行   显色液配方不恰当   增加显色底物的量   二抗结合不够   提高二抗浓度，延长反应时间，更换效果更好的二抗   梯度稀释做ELISA时产生跳孔现象   酶标板叠放导致传热不均匀，各孔反应温度有差异   尽量避免酶标板叠放在一起   移液器稀释时未能保持连续性   定期校准移液器，确保移液器的正确使用   反应溶液蒸发   酶标板用封条密封或者加盖   洗板不均匀   确定洗板机能够正常工作   酶标板底有杂物或者水珠   读板时清理干净酶标板底部   

ELISA快速检测技术越来越多的用于疾病诊断、食品安全检测中，那么elisa试剂盒的主要组成成份是什么呢？根据ELISA试剂盒的应用范围，可将ELISA试剂盒分为拿几种呢？完整的elisa试剂盒主要的组成成份如下：(1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);(2)C的抗原或抗体(结合物);(3)酶的底物;(4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中)，参考标准品和控制血清(定量测定中);(5)结合物及标本的稀释液;(6)洗涤液，在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水;(7)酶反应终止液，常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。常见的ELISA试剂盒都有哪些？一、食品安全检验ELISA试剂盒是指食品中的激素、药物、霉菌毒素、过敏原残留、转基因产品的检测试剂盒，以及微生物、维生素等的检测产品。包括植物病毒、细菌、真菌、植物激素和转基因作物的农业诊断试剂盒，以及动植物疾病诊断类如猪、牛、羊、马等家畜和禽类以及宠物类检测试剂盒。二、生物原装ELISA试剂盒以及各类国产ELISA试剂盒1、细胞因子检测试剂盒：如白介素、选择素、集落刺激因子，肿瘤坏死因子，干扰素，转化生长因子，趋化因子，细胞因子受体，粘附分子，生长因子，凋亡因子等等2、心肌梗塞检测ELISA试剂盒如肌钙蛋白，肌红蛋白，C-反应蛋白等等3、内分泌检测ELISA试剂盒如甲状腺，胰腺，性激素，孕酮，睾酮，生长激素，生长抑素，内皮素，皮质醇，骨钙素，催乳素，促肾上腺皮质激素，促卵泡素，雌二醇，雌三醇，5-羟色胺，17-羟孕酮等等4、肝纤维化检测ELISA试剂盒如纤维连接蛋白，透明质酸，胶原，基质金属蛋白酶抑制因子，基质金属蛋白酶，层粘蛋白等等5、自身免疫检测ELISA试剂盒如甲状腺，盐水可提取核抗原抗体(ENA)，抗核抗体，DNA，抗心磷脂抗体，类风湿因子，循环免疫复合物，抗胰岛细胞抗体，胰蛋白酶原，Sm，大疱性类疱疮，蛋白酶，短膜虫法，肝-肾，肝-肾-胃，肌内膜抗体，角蛋白抗体，抗核抗体，抗核糖体蛋白抗体，抗聚角蛋白微丝蛋白抗体，抗链O，抗卵巢抗体，抗平滑肌抗体，抗线粒体抗体，等等7、优生优育检测ELISA试剂盒如早早孕，新生儿TSH，胎膜早破检测，抗子宫内膜抗体，抗心磷脂抗体，抗透明带抗体，抗卵细胞透明带抗体，抗卵巢抗体，抗精子抗体，巨细胞病毒，弓形体，风疹病毒，分娩预测，单核白细胞增多症，单纯疱疹病毒，促卵泡素，促黄体生成素，便隐血试纸，HCG等等8、传染病检测ELISA试剂盒如幽门螺杆菌，乙脑，乙肝，丙肝，丁肝，戊肝，庚肝，衣原体，性病，腺病毒，微小病毒B19，天疱疮，水痘-带状疱疹病毒，生殖支原体，伤寒，沙眼，腮腺炎，人型支原体，麻疹，轮状病毒，流行性出血热，淋球菌，莱姆病，柯萨奇，抗解尿支原体，军团菌，结核，胶原，尖锐湿疣，甲肝，脊髓灰质炎，急性胰腺炎尿胰蛋白酶，霍乱，呼吸道合胞病毒，肝吸虫，副流感，肺炎，带状疱疹，传染性单核细胞增多症，层粘蛋白，布鲁氏杆菌，百日咳，白喉，艾柯病毒，EB 病毒，A族链球菌等等9、特种蛋白检测ELISA试剂盒如免疫球蛋白，抗链O-aso，类风湿因子RF，C反应蛋白，微量白蛋白，β-2微球蛋白human，铁蛋白，转铁蛋白transferrin等等10、肿瘤标志物检测ELISA试剂盒如肿瘤标志物，组织多肽抗原，肿瘤相关因子，胰腺癌，直肠癌，细胞角蛋白片段，胃肠癌，铁蛋白，糖链抗原，神经特异性稀醇化酶，上皮膜抗原，乳腺癌，人抗小鼠抗体，前列腺，甲胎蛋白，肝癌，大肠癌，肺癌，大小便隐血检测，癌胚抗原，β-2微球蛋白等等ELISA试剂盒产品大全，主要包括：小鼠ELISA试剂盒、人ELISA试剂盒、马ELISA检测试剂盒、病原ELISA检测试剂盒、大鼠ELISA试剂盒、猪ELISA试剂盒、牛ELISA/EIA试剂盒。

一、原理植物激素（planthormone）免疫定量主要有放射免疫分析（RIA）和酶联吸附免疫分析（ELISA），由于前者操作上欠安全等原因，目前常采用后一种类型。在ELISA中，抗原抗体反应的检测依靠酶标记物来实现，常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。酶可直接标记激素分子，称为酶标植物激素，也可标记于第二抗体（识别抗激素抗体Fc片段的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白），称为酶标二抗。这两类标记物分别用于固相抗体型和固相抗原型ELISA。A.固相抗体型ELISA：将抗激素的单克隆抗体（Mab）与已吸附于固相载体上的兔抗鼠Ig抗体（RAMIG）结合，然后加入激素标准品或待测样品，使其与固相化的Mab结合， 再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记激素（酶标激素）。通过测定酶标激素的被结合量，可换算出未知样品中激素的数量。B.固相抗原型ELISA：将“激素-蛋白”复合物（该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白）包被于固相载体，加入待测激素（样品或标准品）和抗IAA多克隆抗体（Pab）反应，进行竞争反应。然后让HRP标记羊抗兔Ig抗体（HRP-GARIG）与结合在固相上的Pab反应，通过测定与固相结合的酶量，换算出未知样品中激素的含量。二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：高等植物、真菌、藻类等组织或器官。（二）仪器设备：1. 酶联免疫检测仪；2. 高速冷冻离心机；3. 恒温箱；4. 连续进样器；5. 涡旋仪；6. 96孔微孔板；7. 离心管；8. 研钵或匀浆器；9. 试管。（三）试剂1. 洗涤缓冲液：0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液（PBS），含0.05％Tween-0；2. RAMIG溶液，或“激素-蛋白”复合物；3. 0.1％封闭蛋白（该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白）；4. 抗激素Mab，或Pab；5. 激素标准品母液，及参比系列溶液（按双倍或四倍系列稀释）；6. HRP标记激素，或HRP-GARIG；7. 邻苯二胺（OPD）基质液：5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS，用前加入30％H2O212.5μl。三、实验步骤 固相抗体型elisa。1. 用方阵法滴定选择各反应物最适工作浓度；2. 将100μlRAMIG溶液包被聚苯乙烯反应板微孔，4℃湿盒，12h；3. 弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，甩干；4. 加入100μl抗激素Mab溶液，37℃70min；

可溶性白细胞介素2受体SIL-2R存在于人的血清、尿液及脑脊液中，其浓度的高低与许多疾病的发生、发展、治疗效果及预后有密切联系，如成人T淋巴细胞白血病(ATL)艾滋病、B细胞慢淋、毛细胞白血病，以及肾移植后发生急性排斥反应时或异基因骨髓移植发生移植物抗宿主时，患者血清中SIL-2R水平明显升高。SIL-2R的检测多采用酶联免疫吸附技术，其中夹心法ELISA是一种较简单的检测方法，国外已广泛应用于临床及基础免疫学研究。㈠ 基本原理：将抗Tac特异性单克隆抗体Ab1吸附于固相载体，识别细胞培养上清或血清等标本中Tac并与之结合。应用辣根过氧化物酶标记的识别另一种Tac表位的特异性单克隆抗体Ab2识别固定于固相载体的Tac并与之结合。通过酶催化底物显色反映待检标本中游离Tac的水平。㈡ 操作步骤：1. 刺激外周血单个核细胞(PBMC)：取外周血10ml，肝素抗凝，常规分离单个核细胞，加至24孔细胞培养板，2×106/孔，RPMI1640-10%FCS+PHA(3μg/ml，Wellcome公司，37℃、5%CO2培养72小时,收集上清，-20℃保存待测。同时设未加PHA对照组。犚2可选用病人血清为待测标本。2. Ab1包被：用0.05MpH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗Tac特异性单克隆抗体(Ab1)犗!释至5μg/ml，加至elisa板，100μl/孔，4℃包被72小时。3. 封闭：1%BSA-PBS封闭，350μl/孔，37℃孵育2小时。4. 加样：ELISA板用PBS-T洗液洗3次，牻+PHA刺激单个核细胞培养上清及对照组上清或病人血清倍比稀释至1∶1024，每一稀释度取100μl加至ELISA板。犙!HUT-102B2细胞培养上清为阳性对照，RPMI1640-10%FCS培养液为阴性对照。37℃，孵育2小时，洗涤。5. 加酶标抗体：于各反应孔加辣根过氧化物酶标记另一种抗 Tac 特异性单克隆抗体Ab2以效价滴定的最佳稀释度稀释)100μl。37℃孵育2小时，洗涤。6. 加底物显色：各反应孔加新鲜配制ABTS底物溶液100μl，37℃、孵育15分钟。7. 终止反应：各反应孔加2%氟化钠终止液50μl。8. 结果判定：首先肉眼观察反应孔内颜色，稀释梯度是否均匀。阳性、犚u性结果是否明显。然后于ELISA检测仪上测各孔O.D值(410nm)。㈢ 试剂器材：1. 试剂：包被缓冲液、洗涤液、稀释液、终止液配制同常规ELISA方法。Tac特异性单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的Tac特异性单克隆抗体,HUT-102B2细胞培养上清,PHA。2. 器材：聚苯乙烯塑料板，ELISA检测仪，37℃水浴箱，4℃冰箱，CO2孵箱。可调加样器。㈣ 注意事项：1. 包被抗体活性要较高，否则影响本实验敏感性。2. 经筛选比较，封闭液以1%BSA-PBS为好。3. 酶标结合物应用前应进行效价滴定，选择最佳工作浓度。4. 底物应选用灵敏度较高的供氢体如ABTS等。5. 如有条件，酶标McAb可由生物素-McAb和亲和素-HRP系统代替，以增加实验的敏感性。

elisa实验操作中常见问题分析由于 ELISA(酶联免疫试验)具有灵敏度较高、特异性好的特点，已广泛应用于各种传染性疾病的筛查如肝炎、爱滋、优生优育等。虽然洗板只是ELISA实验重要环节中的一个，但作为专业的洗板机生产厂家，我们必须对影响ELISA实验结果各因素有一定的认识。优质的 试剂 ，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。如不注意，就易出现白板、花板、色弱和假阳性等现象。尤其是花板现象(就是空白、阴性、阳性对照以及室内质控孔结果正常，而标本孔的OD值却明显偏高)是各个厂家洗板机调试中经常遇到的问题。现将ELISA实验操作中注意事项总结如下，以期给大家带来一些启发，以改善洗板机的安装调试水平，提高临床检测质量。1 标本及采集、贮运因素严重溶血 ，以 HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性; 混有红细胞的血清 易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净;如有 细菌污染 ，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应; 标本凝固不全 ，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果; 采血试管洗涤不彻底 、反复使用易交叉污染; 塑料试管能吸附抗原物质 ，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的 试剂 本底加深。超过一周测定的需-20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使 抗体 效价跌落，所以测 抗体 的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存;最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管;并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关;EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性;血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。2、试剂的影响ELISA 诊断试剂经历了从合成肽向基因工程抗原的过渡。由于历史的原因，人们往往以反应本底的好坏来衡量ELISA 反应 试剂 盒，因此有些厂家为了保持较好的本底采用了单片段基因工程抗原及合成肽包被，该类 试剂 盒的流行病学敏感度不够，稳定性也成问题。也有厂家坚持 试剂 盒高的流行病学敏感度，科学地对待反应结果。基因工程抗原较合成肽抗原有无可比拟的优越性，就HCV-ELISA 试剂 盒来讲，第一代产品为合成肽抗原，主要是HCV 特异性抗原决定簇的肽片段;第二代产品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是当时的基因工程抗原不全，仅包括了HCV 的核心区片段;第三代产品基本上采用了基因工程抗原，而且这些抗原包括更多、更稳定、纯度更高的HCV 特异性抗原。第三代 试剂 的敏感度大大提高了。基因工程抗原与合成肽抗原的区别如下：基因工程抗原是抗原基因在质粒载体中原核或真核表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或 酵母 菌为表达系统。该类抗原与合成肽相比具有以下特点：a.分子量大。合成肽采用化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸;而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。b.稳定性好。包被的抗原的稳定性可使 试剂 盒的效期得到保证，早期以合成肽为包被抗原的 试剂 盒效期只有3-4 个月，采用基因工程抗原后效期大大延长了。c.基因工程抗原将特异性抗原决定簇基因融合表达，表达产物包含更多的抗原决定簇，可提高 试剂 盒的灵敏度，提高检出率。d.纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点： a.分子量太小;b.一般只含有一个抗原决定簇;c.纯度高;d.稳定性差。国内乙肝两对半试剂厂家较多;不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为 89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%;标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。? 选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳定性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的主要依据。? 要注意试剂的批号和出厂日期，虽然试剂的有效期多为 1年。最好选择刚出厂的试剂使用。不同厂家的试剂不能混用。不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用 ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外;还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。3、操作技术的影响操作过程的控制：⑴ 严格按照试剂说明书进行操作。操作前将试剂在室温下平衡30～60min。⑵ 加样后及时放人孵箱。标本较多时，要分批操作。按说明步骤严格控制操作时间，防止孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。(3)封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发，产生周边现象从而导致“花板”的出现。(4)用洗板机洗板时，保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸(选择干净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干：还要防止针口有纤维蛋白或异物，这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板”的出现。(5)合理安排检测量，以免反应板过多造成洗板等待时间长。(6)加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。(7)显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用。(8)加样时保持显色剂不外流;A、B液应避免接触金属器械。加终止液时应避免产生气泡。(9)应保证C清洁，整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。以上的措施可以使“花板”降至最低限度。从而提高检测的特异性。并得到更准确、可靠的实验结果。加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊，导致清洗困难，加大了交叉污染的机会。建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗，定期校准。加样时应将所加物加在 ELISA 板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出。温浴影响，在建立 ELISA 方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原 抗体 反应一般在37℃经1-2 小时，产物的生成可达顶峰。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。由于公司的 试剂 盒温育是在空气浴中完成，采用水浴会造成值偏高或花板。另外温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质控放在非边缘位置。96孔酶标板结构特别;易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异;干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA 操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，各种 试剂 盒的洗液不要混用。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。洗液需要稀释，应按要求稀释。配制洗液应用新鲜的和高质量的纯化水，电导率小于1.5μs/cm，洗液如果结晶应待其融解后配制。手洗条件一致性较差，对结果影响较大，防止洗液在孔内形成气泡。半自动与全自动冼板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性;所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清冼几遍。保证洗板浸泡时间为 40 秒左右，孔内液体被洗板机吸得越干净洗涤效果更好，手工洗板4.显色和比色TMB 经HRP 作用后，约40 分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2 小时后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠(SDS)等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色维持较长时间(12-24 小时)不褪，是目视判断的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA 结果吸光度的光度计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为±1%，重复性达0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15 -30℃ ，使用前先预热仪器 15-30 分钟，测读结果更稳定。测读 A 值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm 波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长(W1)，第二次在不敏感波长(W2)，两次测定间不 移动ELISA 板的位置，最终测得的A 值为两者之差(W1-W2)。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测，以保结果一致性。5.HooK效应影响随着ELISA一步法的应用，一些标本中抗原含量过高，产生HooK效应。影响检测结果，采用同步稀释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减HooK反应的发生。6.干扰物质的影响有人认为大约 40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果;常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性，补体从C1q活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc的C1q分子结合点暴露出来，则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性，采用56℃30分钟灭活补体可降低假阳性率，高浓度的AFP(如孕妇)，在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。7.药物的影响高效价的乙肝免疫球蛋白会与 HBsAg形成复合物，影响HBsAg的检出，所以一些HBsAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg检测会呈阴性反应，导致乙肝两对半少见模式的出现，如我们常遇到乙肝大三阳的孕妇，为阻断乙肝母婴垂直传播时，在孕第8、9、10月常规注射200mg乙肝免疫球蛋白，不仅影响孕妇HBsAg的检出;而且其所生产的生新儿也常出现HBsAg阴性，HBeAg 阳性和HBcAb阳性等少见模式、可能是乙肝免疫球蛋白属IgG抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的HBsAg结合形成复合物;则新生儿HBsAg检测呈阴性;用0.5M的盐酸处理标本1小时可提高出率。为预防乙肝，部分 HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗后的1—2周内，血清中可检出HBsAg成份，形成一过性HBsAg阳性，这可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能够把它检出;如电化学发光法，建议接种乙肝疫苗后1个月内不应作HBsAg检测。8.抗原自身因素融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响。以丙肝诊断 试剂 盒为例为例，因为包被的基因工程抗原为融合蛋白，包含了来自表达载体的一些序列可以与血清中抗大肠杆菌的因子发生反应而产生了可疑标本。少数 HBV感染后外周血中不含HbsAg。HBV感染后绝大多数感染者外周血中可出现HBsAg， 含量在5ng～600μg/ml之间。据文献报道，到目前为止在献血员中所发现的HBsAg 携带者最低含量为0.2 ng/ml。含量高者可达2000μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg测定为阴性，如暴发性乙型肝炎、HBV的S基因发生变异等。急性重症乙型肝炎，肝细胞中以合成HBcAg为主，很少或不合成HBsAg，从而使外周血中无HBsAg。HBV的前S/S基因编码HBsAg，构成病毒外膜，根据所带亚型决定簇的不同分为adw、adr、ayw和ayr。a决定簇具有很高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg 疫苗可引起抗HBs应答。如S基因145密码子变异使得其原来的甘氨酸被精氨酸替代时，可致a决定簇的抗原性发生改变，使机体产生的抗体对变异株无作用，且可引起HBV感染患者血清中同时出现HBsAg和抗HBs。同时乙肝疫苗接种也不能有效预防此类变异病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的变异有自然变异和逃避免疫变异，变异可发生在多个部位，而且几处突变可同时存在，这些变异有助于病毒携带状态的持续存在。近来，有研究表明，前S1区丢失突变(氨基酸58～118)是引起HBsAg阴性的HBV感染的重要原因，S启动子位于前S1，是合成HBsAg的调节元件，前S1的丢失突变则会影响S启动子的功能，进而影响HBsAg的合成。总之，优质的 试剂，良好状态的仪器，排除各种影响因素的干扰和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。异常   结果描述   原因分析   对策   白板   显色步骤结束后，酶标板所有孔均无颜色。阳性对照不显色。   试剂已过效期，或不同试剂盒组分混用   检查试剂的组分及批号，确认未过期以及所有组分均属对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。   错加、漏加试剂底物、显色剂 A或B   严格按说明书的步骤操作，加完试剂后可观察一下液面高度是否一致，以减少漏加现象。   洗板及加样过程中，酶标受污染失活失去催化显色剂显色的能力   确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净。   终止液误作洗涤液稀释或当底物缓冲液配制   每次配制时都应看清标签标明物质。   蒸馏水有问题   确认配制洗液的纯化水达到要求且未污染，与好蒸馏水比较。   显色弱、灵敏度低   实验结束后，包括阳性对照、质控在内的所有板孔颜色均较淡。   试剂盒超过期， 超过有效期的产品可能会产生很弱的信号； 试剂盒没有按规定进行保存，受高温影响；   实验前检查试剂的组分及批号，确认试剂未过期。 不要将试剂盒长时间置于常温下，按使用规定储藏。   试剂、样品用前未平衡至室温   从低温冰箱中取出的试剂及样品应置室温平衡 20分钟左右。   加入试剂的体积和时间有误， 移液器计量不准，吸嘴内水分太多或不清洁；   确定所使用的试剂体积正确，加入时间适当。 校正移液器，移液器与吸嘴配合要紧密吻合。移液不宜太快，排放应完全。   洗板及加样过程中，酶标受污染失活而失去催化显色剂显色的能力；   确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗干净，确认配制洗液的纯化水达到要求且未受污染。   孵育时间及孵育温度未达到要求 ，反应板放入培养箱时注意温度并及时调整。   孵育温度应控制在 37-38℃，孵育时间严格按照说明书操作。 保温期内不宜多开门，以免影响保温。   洗板次数过多，或浓缩洗液稀释倍数不符合要求；洗涤冲击力太大。浸泡时间太长；   严格按说明书要求稀释浓缩洗液及洗板，减小洗涤冲击力，按说明书要求置留洗涤液时间和洗涤次数。   显色剂加量不足或顺序颠倒，或混合后加入；   显色剂滴瓶垂直向下，持力均匀，滴速不宜过快，先加显色剂 A，后加显色剂B，不可将A、B液混合后加入。   底物作用时间不够；   准确定时。   蒸馏水水质有问题；   测定蒸馏水配制试剂对酶免疫法的影响。   实验结束后，阴阳性对照正常，质控正常，但临床标本感觉显色较弱   待测标本中可能不含强阳性标本，故结果可能是正常的   如有怀疑，可复检   标本加入叠氮钠作为防腐剂   酶免实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂，可选用 proclin、硫柳汞等其他防腐剂   阴阳性对照正常，但质控、参考品或个别弱阳性标本未能检出。   未达要求的孵育温度及孵育时间可检出强阳性标本，但 质控或弱阳性标本受 温度变化影响较大而被未检出。   确认孵育的温度及孵育时间达到要求。   质控品或标本高温放置过久，或被反复冻融致待测物滴度下降，而未能检出   质控品或标本避免反复冻融。标本在一周内使用的，可存于 2-8℃，如需长期保存，应置于-20℃以下保存。质控品应小量分装，并置于-20℃以下保存。   仪器设定不正确，滤光片不匹配。   重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。   终止后，目测结果正常，但酶标仪读值结果偏低   酶标仪参数设定不正确。   重新设定酶标仪的参数，特别是检查滤光片是否匹配。   灵敏度过高、板底高、高背景   终止后，整板结果显现均一的黄色或淡黄色；或阴阳性对照、质控正常，标本阴性标本 OD值过高。   整板的黄板现象可能是由于错加其他试剂造成，如同时操作两对半试剂时，测 HbsAb板用于测HBsAg等；   实验前检查试剂的组分及批号，确认所有组分均属于对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。   酶标对吸头的污染以及对盛放显色剂容器的污染都易造成黄板现象；   避免试剂组分间的交叉污染，确保吸头、容器的干净。   显色剂在光照条件下放置过久，实验前已变蓝   显色剂 A、B未使用前避光保存   孵育温度过高或孵育时间过长；   孵育温度应控制在 37-38℃，孵育时间严格按照说明书操作。   未按要求洗板。特别是洗涤时每孔未注满洗液，易造成花板黄板现象   严格按说明书要求洗板。   花板，一般是由于临床标本的收集、处理和保存方法不当造成   放置时间（自然放置 1~2h）及离心转速（3000r/min）、离心时间（15min）应引起注意。   出现随机性的花板、跳孔现象   样品离心不完全，反应孔内发生凝血或残留细胞成分；   充分离心， 3000rpm6分钟以上。   加样时交叉污染；   加标本时尽量 避免交叉污染。如盛标本的试管周围常有血痂，易脱落，应远离酶标板。   手工洗板造成的交叉污染   手工洗板时前 3次注洗液后应立即弃去，后几次再设定浸泡时间，可减少交叉污染   洗板机加液头堵塞导致加液不满或吸液残留量较大，造成 花板、跳孔   疏通加液头，使洗板时每孔均注满洗液，吸液时残留量要小。   拍板时交叉污染   洗板完毕拍板时用合适的吸水纸巾，不要把无关物质拍进板孔，并尽量不要在同位置拍，以免交叉污染。   假阳性   假阳性现象是一个综合现象，可参考上文 “灵敏度过高、板底高、高背景” 中的分析。这里只列举常见的原因及对策。   计算 Cutoff值时使用的公式不正确，导致计算得出的CutOff值过低，从而导致出现假阳性   CutOff值计算公式应严格参照所属产品的说明书，应注意各个酶免产品的Cutoff值计算公式不尽相同。   洗板时未能注满洗液或洗板次数、浸泡时间不够， 洗涤不充分，样品中有其他成分残留 导致花板、跳孔，假阳性增多   严格按说明书要求洗板。调整洗板机时，应注意有时仪器标示的液量与实际液量并不相符，应根据实际情况调整至每孔注满。   血清标本处理不当，如未除去细胞成分、纤维蛋白原及其它干扰物可出现孔底由变蓝的跳孔现象，此标本重复实验结果往往是阴性；   放置时间（自然放置 1~2h）及离心转速（3000r/min）、离心时间（15min）应引起注意。   厂家试剂质量的变化造成；   国家标准要求提高灵敏度时，厂家试剂灵敏度也相应提高，假阳率常常有所上升，但只要在合理范围，是可以接受的。   水质问题；   防止蒸馏水污染。   加酶量过多（如 50uL误认为100uL）或丙肝酶稀释时加量过多；   加酶前检查移液器调节量是否准确，稀释酶时思想要集中。   培养箱温度超过 37℃或酶结合物反应时间或底物显色时间超过；   放入板以前要检查培养箱的温度，准确定时。   底物配制时间过长、或底物污染；   底物应在酶反应完毕即将洗涤前 5分钟配制，注意避光。   该批样品放置时间过长，样品污染；   样品应保持新鲜，或低温保存，防止污染。   移液嘴重复使用，未洗净或消毒不完全而用于加酶或底物；   移液嘴尽可能一次性使用。   重复性差   1、样品数量不一，加样时间长短不一；   重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近。   2、样品加入后未混匀；   加样后在混匀器上充分混匀。   3、酶标仪滤光片不对或输入波长不对；   TMB显色用450/630波长.   4、酶标仪测定重复性差；   校对酶标仪。   5、洗涤不正确；   洗涤液注满各孔但不要溢出。洗板时反应板面向下，垂直用力甩净内容物（可多甩几次），在干净、无或少尘的吸水材料上拍干。洗板机洗板时不应有堵孔，洗涤应充分。   6、温育条件不一致（一次用水育，一次用恒温箱）   恒温箱温育较水浴显色深， OD值高出0.1-0.15,最好均采用恒温箱.如用水浴水温应控制在37℃。   7、不慎多加或少加酶或显色剂；   多加时显色深，少加则浅，用记号笔圈上，便于分析。   8、阈值附近时阴时阳；   同一样品做三个复孔，以二个（含二个以上相同结果为准）   9、加样量不足、保温时间、洗涤条件一致；   尽可能使用同一移液器和装紧吸嘴重复测定标本。条件、人员等应尽量与上次保持一致。   

ELISA检测系统可谓是免疫学反应应用到科研生产中最为广泛最为灵敏的技术手段。可是在新老手操作过程中总是会出现或大或小的问题，本人在刚开始做ELISA时就面临很多困难，虽然有师兄师姐铺路，但还是常常做得一塌糊涂，比如说花板，假阳性，全显色，全部显色，显色比空白还低。。。。。。自己也为此苦恼过很长一段时间，随着自己技术水平得提高，或多或少地也掌握了ELISA体系的脾气，也是熟能生巧吧，现在做方阵，做ELISA已是轻车熟路了，以前检测一种抗体用整整一下午还算得晕晕的，现在给我十个八个的从包被到显色，一个工作日基本搞定。下面就由我抛砖引玉地来说一下，做ELISA的经验总结:1、包被原的性质很重要，蛋白浓度，是否降解，这关系到你做出的抗体可不可以被其识别，所以保存抗原很重要，我做重组蛋白时，师兄都严格警告我一定要在冰浴下缓慢融化就是这个道理。还有有的包被原可能不是蛋白，对于生物素和脂类物质或小分子物质我们要事先对其改造再加以包被，我把方法简要的列出如下:①亲和素生物素:先亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。②脂类物质:可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。③小分子必须依靠和大的蛋白载体偶联后才能固定在固相载体上。2、包被液的选择，一般选择ph9.6的碳酸盐缓冲液。但有时由于试验的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的缓冲溶液来包。应注意以下原理：由于蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用，这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。具体的试验还要有坚固的理论外也要实践，看一下最终可不可以应用到自己试验当中去。常用的包被液除了刚才提到的pH9.6碳酸盐缓冲液，还有pH7.2的磷酸盐缓冲液和pH7-8的Tris-HCL缓冲液等等。3、封闭：继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉，比较价廉，可以高浓度使用(5%-10%);还有一些稀有用到的各种动物血清(主要为了排除相似蛋白干扰)和酪蛋白等等。但最终选用什么，要依据试验具体来实践。4、洗涤板：可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。因为聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，为达到分离游离的和结合的酶标记物的目的，清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质，在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。所以在洗板时会有一定误差，人为因素很大(当然有条件的用洗板机除外)，洗的不彻底或串了孔，对如此灵敏的ELISA系统可是不小的影响。5、加抗体标本(和二抗):注意该换枪头时换枪头。标本稀释一般可用PBS稀释，也可用封闭液去稀释。如需加二抗，还要注意二抗的工作浓度，太高浪费，太低则着色浅。6、显色:显色系统又很多，我们一开始做的时候，要选择适宜的显色系统。注意显色系统酶活性底物的保存HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠。7、每次做尽量要把阴阳空三个对照做好，如出现问题也好分析。相关知识：1、问：做间接Elisa法测试小鼠血清中的IgE抗体，设空白对照、和阴性对照、阳性血清稀释倍数为5千、1万、10万、20万不等，用的是生物素标记的羊抗鼠IgE抗体，和亲和素的辣根过氧化物酶。可是结果除了空白对照孔没有颜色外，其余各孔全有颜色，而且OD值都相差不大，为什么?回答：可能原因如下：(1) 水质被金属离子等污染;防止办法尽量使用新鲜水或蒸馏水。(2) 洗涤不充分，样品中其它成分残留或酶残留;防止办法洗涤液应注满微孔，充分洗涤。(3) 移液头重复使用，未洗净或消毒不完全; 防止办法移液头最好一次性使用。(4) 酶标板灵敏度过高。(5) 一抗显色时间的控制等等，关于ELISA的每一步都要注意才行。2、ELISA加样时的防错小经验(1)用一张写满字的纸，字越多越好，比如报纸，垫在下面，这样，加过标本的小孔看过去下面的字会变小，没加的字正常，非常容易区分。(2)可以利用液面反光与没有加的孔加以区别(3)在标本加完后，再把加样枪全压下，使液面产生小气泡，也可以加以区分3、棋盘试验的操作方法:(1)将抗原按一定的梯度倍比稀释后，按照ELISA从上到下(或者从左到右)的顺序包被。(2)将抗体按一定的梯度倍比稀释后按照ELISA从左到右或者从上到下加入。(3)二抗的稀释倍数是一定的，然后显色，读值。OD值的测定时，波长要根据显色剂的不同而定，一般上大家都使用TMB显色，450nm读值。根据读值得结果可以选定合适的抗原和抗体效价，这就是棋盘 实验的目的，如果抗原包被量已知而二抗的工作浓度不确定的话就用一抗和二抗作棋盘试验。

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注意事项 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未 用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好 控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值 大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计 算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物请避光保存。 7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9．本试剂不同批号组分不得混用。 10. 如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

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据英国《泰晤士报》14日消息：英国苏格兰科学家成功从人类的干细胞培养出人造血液，并将进行临床实验，一旦成功，将可大量生产，无限量供应各种血型的血液。这项为2016年计划的研究将为大规模制造血液铺路。科学家说这种血将可以最终取代捐血，成为病人血液的主要来源。廉价稳定供血苏格兰国家血液服务中心医疗总监特纳（Marc Turner）领导的研究团队，花了几年时间，投资500万英镑，透过“经诱导产生的万能干细胞”（induced pluripotent stem cells，简称iPS）培养出血红细胞。目前人造血红细胞的培养过程需时约一个月，成功率已可达4至5成。特纳说：“这是人类首次制造出适合用于人体的血红细胞，史无前例。”该团队将对3名地中海型贫血（Thalassaemia）病患者进行临床实验，将5毫升人造血液注入体内，测试细胞能否正常运作。特纳估计，20年后人造血液很可能成为主流，但强调现阶段不应停止捐血。英国利物浦大学组织工程中心主任亨特同意这个看法。他说：“如果人们停止捐血，保健系统将会崩溃。但如果将来人造血可投入大规模使用，则能让全球血红细胞的供应维持稳定。”而且，长远而言，人造血比每个单位要120英镑的捐血要便宜的多。地贫患者福音采用人造血也许在健康上有好处。血细胞在人体内可存活约100天，且会不断再生，因此捐赠的血液包含新旧细胞；而人造细胞则全是新细胞，这样的话，原本每2至4星期便需输血一次的地中海贫血病患者，便可减少输血次数。理论上，这种方法可以无限量供应既没有疾病而且与病人血型兼容的人造血。但实际上，提升这个过程是有挑战性的。

ELISA法检测幽门螺杆菌抗体的临床意义　　本研究用间接ELISA法检例患者和健康输血员血清中抗HpIgA、IgG同时还检测了胃粘膜中的Hp，以探讨Hp抗体测定的临床意义。　　1　材料和方法　　1.1　材料　　本组217例患者经胃镜及胃粘膜组织学诊断为十二指肠球部溃疡（DU）48例，胃溃疡（GU）27例，慢性萎缩性胃炎（CAG）18例，慢性清表性胃炎（CSG）96例，复合性溃疡（CU）7例，胃癌（GCa）14例，胃粘膜正常2例。慢性胃炎中活动性胃炎（ACG）54例，非活动性（NACG）60例。所有患者均抽取空腹静脉血，此外还收集了80例健康输血员血清测抗HpIgA、IgG。　　1.2　方法　　①胃粘膜内Hp菌检测活检粘膜直接涂片检查及Hp的分离培养鉴定均参照张振华所报道的方法。②ELISA方法：从患者胃粘膜中培养出的7株Hp菌分离纯化，超声粉碎后在4℃下1500g离心30min，取上清蛋白定量后作抗原。用50mg/ml的抗原包被聚苯乙稀反应板，用间接ELISA法测定，每板均设标准阳性和阴性对照，将两者OD值用作为质控，每板此值之差在±0.5范围内。结果用特测标本OD值与标准阳性OD值之比来表示，该比值在血清IgA≥0.6，在IgG≥0.5为阳性，在胃液IgA≥0.145为阳性。③吸收抑制试验：用7例在ELISA试验中高效价IgA、IgG的Hp感染者的血清混合后从1：10开始对倍稀释至1：160，然后分别用Hp、空肠弯曲菌（CJ）及大肠杆菌完整的细菌和Hp抗原吸收后，按上述方法做ELISA。　　计数资料用卡方检验，计量资料用t检验。　　2　结果　　Hp阳性患者血清中抗HpIgA、IgG含量均显著高于Hp阴性者（P＜0.01）。与细菌学比较其敏感性分别为92.1％和95.7％，特异性分别为91.1％和88.5％，符合率分别为71.7％和93.2％（表1）。可以看出不同疾病之间的血清抗HpIgA和LgG含量有显著差异（P＜0.01），两组比较发现血清IgA含量在ACG组显著高于除CU外的其它各组（P＜0.05，P＜0.01），消化性溃疡各组显著高于NACG组（P＜0.01），2例组织学正常者IgA、IgG分别为0.44和0.37，80例健康输血员血清抗HpIgA，IgG的含量和阳性率均显著低于ACG，GU，DU及GCa组（P＜0.01，P＜0.05）。研究表明，血清Hp抗体与胃炎的严重程度有关，中重度胃炎血清抗HpIgA，IgG的阳性率为82.4％和79.0％，显著高于轻度胃炎的45.6％59.7％（P＜0.01，P＜0.05）。但Hp抗体含量和阳性率在浅表性胃炎和萎缩性胃炎之间无显著差异（P＜0.05表2）。表1　胃粘膜内Hp和血清Hp抗体的比较胃粘膜HpnIgAIgGX±S阳性数（％）X±S阳性数（％）阳性1390.79(0.19)128(92.1)0.65(0.13)133(95.7)阴性780.50(0.1)7(9.0)0.45(0.13)9(11.5)表2　各种胃部疾病血清抗HpgA，IgG比较病 种nIgAIgGX±S阳性数（％）X±S阳性数（％）ACG540.82(0.2)49(90.7)0.69(0.1)51(94.4)NGCG600.53(0.2)22(36.7)0.47(0.1)23(38.3)GU270.71(0.2)19(70.7)0.59(0.2)20(74.1)DU480.71(0.2)31(64.6)0.57(0.2)34(70.8)CU70.86(0.4)5(71.2)0.58(0.1)5(71.2)GCa140.68(0.2)8(57.1)0.55(0.1)8(57.1)RG50.54(0.1)120.00.52(0.2)1(20.0)输血员800.47(0.2)27(33.8)0.43(0.2)25(31.3)　　Hp阳性患者胃液中抗HpIgA显著高于Hp阴性者（P＜0.01），与细菌学结果比较敏感性，特异性与符合率分别为96.4％92.9％和95.3％（表3）。表3　胃粘膜内Hp的检出率和胃液抗HpIgA的比较胃粘膜nX±S阳性数阳性570.438（0.234）55（96.5）阴性280.101（0.045）2（7.1）　　不同疾病之间胃液抗HpIgA含量有显著差异（表4，P＜0.01），两组比较发现ACG组、消化性溃疡各组和CGa组显著高于NACG组（P＜0.05）。此外中重度胃炎胃液抗HpIgA的阳性率为76.6％，显著高于累度胃炎的40.0％（P＜0.05）。表4　各种胃部疾病胃液抗HpIgA结果病种nX±S阳性数（％）ACG240.497（0.252）22（91.7）NACG210.162（0.161）7（33.3）GU150.281（0.212）10（66.7）DU150.269（0.208）12（80.0）CU30.567（0.298）2（66.7）GCa50.502（0.159）4（80.0）　　无论是完整的Hp菌还是超声粉碎提取的Hp抗原与Hp阳性血清共同温育后都能使血清中抗HpIgA和IgG效价明显下降，而用大肠杆菌和Cj吸收后的血清抗体仅有少许下降，此结果证明本试验具有特异性。　　3　讨　论　　本研究发现Hp阳性者血清抗HpIgA，IgG的阳性率显著高于Hp阴性者。与细菌学检查比较其敏感性、特异性和符合率高达95％～88％，与国外文献报道相似。吸收抑制试验证实本研究所用ELISA法测得的血清Hp抗体可定为特异的针对Hp的免疫反应。因此，ELISA阳性结果强有力支持Hp感染。本研究表明，血清中抗HpIgA、IgG密切反映了消化性溃疡的存在和胃炎的组织学变化。血清Hp抗体在ACG组的阳性率达90％以上，在消化性溃疡为67％和71％，而在NACG中为36％和38％。健康输血员血清中抗Hp抗体显著低于消化性溃疡和慢性胃炎。此外，中重度胃炎血清中Hp抗体的含量和阳性率显著高于轻度胃炎。上述结果表明Hp的血清检测可用来诊断Hp感染和用作筛选胃镜检查患者，这将有助于那些不宜做胃镜检查患者的诊断，并可用于Hp感染的流行病学调查及评价和追踪抗Hp治疗效果。　　Hp寄居不但可引起宿主的全身免疫反应，而且引起胃肠道的局部免疫反应。本研究显示，Hp阳性者胃液中抗HpIgA显著高于Hp阴性者，与细菌学比较其敏感性、特异性和符合率高达96％至92％，高于国外文献报道。本研究结果还表明，胃液中抗HpIgA与消化性溃疡及胃炎的存在和组织变化密切相关。ACG组及消化性溃疡各组阳性率显著高于NACG组，中重度胃炎显著高于轻度胃炎。局部分泌性IgA的确切作用尚不清楚。本研究胃液内抗HpIgA检测的敏感性、特异性均高于血清学试验，这说明局部免疫反应与Hp感染的关系比全身免疫反应更为密切，故检测胃液内抗HpIgA可作为血清学试验的补充，两者结合可进一步提高Hp感染的免疫学诊断准确性。

上海2014年11月31日讯 /生物谷BIOON/ -- 10月31日由生物谷、中国医药城联合举办的2014（第二届）体外诊断产业峰会暨（第三届）POCT论坛在江苏泰州锦泰宾馆隆重开幕。众多科研院所的专家以及业内人士齐聚泰州。来自丹娜（天津）生物科技有限公司董事长周泽奇就“ELISA非培养技术在IFD早期检测诊断中的意义与价值”做了详细的报道。侵袭性真菌疾病（Invasive Fungal Disease，IFD）又称侵袭性真菌感染（IFD）。全球每年侵袭性真菌感染人数在2600万左右，IFD发病率以20%的速度逐渐增加，由于缺少早期诊断IFD有效的技术和方法，导致IFD漏诊率和死亡率居高不下，随着2012年中国前卫生部对抗生素专项整治政策的颁布和实施，对临床微生物送检率提出了明确的要求，使得医院及其检验科对于微生物的检测项目有了更高的需求，因此，给病原微生物早期快速检测市场带来巨大的发展机会。我们通过侵袭性真菌多糖生物标记物抗原制备技术平台建立了抗多糖生物标记物抗原的单克隆抗体制备技术平台。在以上技术平台的基础上已经开发出一系列早期快速检测诊断IFD酶联免疫试剂盒产品。并与全国多家三甲医院建立了多中心临床研究合作，加速了侵袭性真菌疾病多想联合检测技术平台的建设。我们的战略目标在以上系列化技术平台上开发一些列侵袭性真菌疾病早期快速检测产品，不断提高我们在该领域的核心竞争力。

ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。在实际应用方面可用于疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。因此，它和生物化学、免疫学、微生物学、药理学、流行病学及传染病学等方面密切相关。按照待测物性质的不同，ELISA反应可以分为抗原检测反应及抗体检测反应。在医学领域上，能够进行检测的抗原包括：内分泌方面的雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等，血液学方面的凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等，肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），此外还有霍乱弧菌、大肠肝菌、绿脓杆菌和破伤风梭菌毒素；脑膜炎球菌及淋球菌抗原；检测免疫抑制病人中常见的白色念殊菌抗原，检测病人或病兽的粪便中的轮状病毒；检测甲肝病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨细胞病毒等。而用ELISA检测抗体，已获得对多种传染病和寄生虫病的血清学诊断，亦开始广泛用于现场流行病学调查。在寄生虫病方面，它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、囊虫、弓浆虫、肺吸虫、肝吸虫、血丝虫、旋毛虫病等血清学诊断，这对人医和兽医都很重要。在病原微生物方面已用于检测链球菌、沙门氏菌、布氏杆菌、结核杆菌、麻疯杆菌、霍乱弧菌、淋球菌、假丝酵母菌等的抗体，还可用于破伤风抗毒素和霍乱弧菌抗毒素的测定以及检测斑疹伤寒立克次氏体感染后的抗体作诊断，也可用于对立克次氏体的种属鉴别，还有用于检测鹦鹉热衣原体抗体的报导。ELISA也可应用于以下病毒抗体检测：流感病毒、腮腺炎病毒、麻诊、风疹、轮状病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒、腺病毒、肠道病毒、脑炎病毒、黄热病毒、狂犬病毒和脊髓灰质炎病毒等，其敏感性都超过目前常用的检测方法。此外，还可用于鉴定病毒型别，例如疱疹病毒。在免疫性疾病方面有试用作自身疫病抗体测定以及对过敏的诊断，例如检测各种过敏原的抗体、DNA抗体及甲状腺球蛋白抗体，红斑性痕疮抗体等等。在卫生学方面，可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等。

ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。主要有：直接法、双抗体夹心法、间接法、竞争法、双位点一步法、捕获法、应用亲和素和生物素系统（ABS）等。ELISA必须遵守以下3个核心原理：（1）抗原或抗体能吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，可根据已知浓度的抗原或抗体的颜色反应的深浅绘制标准曲线并依此计算出未知样品中抗体或抗原的浓度。

良好的酶标板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。酶标板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的酶标板在使用前须事先检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于10%。以下以A、B、C三款酶标板为例。直接法：检测Human IgG在酶标板表面的吸附双抗体夹心法：包被山羊抗人抗体检测阳性血清中抗原由上图可以看出，这三类酶标板中，A类酶标板具有更好的蛋白吸附效果，同时也提高蛋白吸附的灵敏度，能够提供更为可靠的实验数据。另外，可以询问酶标板的批内差异，以下是某款酶标板的批内差异。由批内差异数据图可以看出，该酶标板具有很好地批间稳定性，批内变异系数（CV）差异均在5.0％附近，明显低于业内关于临床免疫反应用酶标板的质量控制标准中批内变异系数低于10.0%的要求，因此也适合用于ELISA实验。

1、如何选用培养基?培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIM V培养基(SFM)。在开始进行新的细胞培养时，可以参考下表所列的条件：细胞系细胞类型种组织推荐使用的培养基293    成纤维细胞    人    胚胎肾    MEM，10% 热灭活马血清    3T6    成纤维细胞    小鼠    胚胎    DMEM, 10% 胎牛血清    A549    上皮细胞    人    肺癌    F-12K, 10%胎牛血清    A9    成纤维细胞    小鼠    结缔组织    DMEM, 10% 胎牛血清    AtT-20    上皮细胞    小鼠    垂体肿瘤    F-10, 15% 马血清和2.5% 胎牛血清    BALB/3T3    成纤维细胞    小鼠    胚胎    DMEM, 10% 胎牛血清    BHK-21    成纤维细胞    仓鼠    肾    GMEM, 10% 胎牛血清 或MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA    BHL-100    上皮细胞    人    乳房    McCoy'5A, 10% 胎牛血清    BT    成纤维细胞    牛    鼻甲骨细胞    MEM, 10% 胎牛血清 和 NEAA    Caco-2    上皮细胞    人    结肠腺癌    MEM, 20% 胎牛血清 和NEAA    Chang    上皮细胞    人    肝脏    BME, 10% 小牛血清    CHO-K1    上皮细胞    仓鼠    卵巢    F-12, 10% 胎牛血清    Clone 9    上皮细胞    大鼠    肝脏    F-12K, 10% 胎牛血清    Clone M-3    上皮细胞    小鼠    黑素瘤    F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清    COS-1    成纤维细胞    猴    肾    DMEM, 10% 胎牛血清    COS-3    成纤维细胞    猴    肾    DMEM, 10% 胎牛血清    COS-7    成纤维细胞    猴    肾    DMEM, 10% 胎牛血清    CRFK    上皮细胞    猫    肾    MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA    CV-1    成纤维细胞    猴    肾    MEM, 10% 胎牛血清    D-17    上皮细胞    狗    骨肉瘤    MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA    Daudi    成淋巴细胞    人    淋巴瘤病人血液    RPMI-1640, 10% 胎牛血清    GH1    上皮细胞    大鼠    垂体肿瘤    F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清    GH3    上皮细胞    大鼠    垂体肿瘤    F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清    H9    成淋巴细胞    人    T细胞淋巴瘤    RPMI-1640, 20% 胎牛血清    HaK    上皮细胞    仓鼠    肾    BME, 10% 小牛血清    HCT-15    上皮细胞    人    结肠直肠腺癌    RPMI-1640, 10% 胎牛血清    HeLa    上皮细胞    人    子宫颈癌    MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA (in suspension, S-MEM)    HEp-2    上皮细胞    人    喉 癌    MEM, 10% 胎牛血清    HL-60    成淋巴细胞    人    早幼粒细胞白血病    RPMI-1640, 20% 胎牛血清    HT-1080    上皮细胞    人    纤维肉瘤    MEM, 10% HI 胎牛血清 和NEAA    HT-29    上皮细胞    人    结肠腺癌    McCoy's 5A, 10% 胎牛血清    HUVEC    内皮细胞    人    脐带    F-12K, 10% 胎牛血清 和 肝素盐 100 ug/ ml    I-10    上皮细胞    小鼠    睾丸癌    F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清    IM-9    成淋巴细胞    人    骨髓瘤病人骨髓    RPMI-1640, 10% 胎牛血清    JEG-2    上皮细胞    人    绒毛膜癌    MEM, 10% 胎牛血清    Jensen    成纤维细胞    大鼠    肉瘤    McCoy's 5A, 5% 胎牛血清    Jurkat    成淋巴细胞    人    淋巴瘤    RPMI-1640, 10% 胎牛血清    K-562    成淋巴细胞    人    骨髓性的白血病    RPMI-1640, 10% 胎牛血清    KB    上皮细胞    人    口腔癌    MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA    KG-1    骨髓白细胞    人    红白血病病人骨髓    IMDM, 20% 胎牛血清    L2    上皮细胞    大鼠    肺    F-12K, 10%胎牛血清    L6    大鼠    骨骼肌成肌细胞    DMEM, 10% 胎牛血清    LLC-WRC 256    上皮细胞    大鼠    癌    Medium 199, 5% 马血清    McCoy    成纤维细胞    小鼠    未知    MEM, 10% 胎牛血清    MCF7    上皮细胞    人    乳腺癌    MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰岛素    WEHI-3b    类巨噬细胞    小鼠    骨髓单核细胞白血病    DMEM, 10% 胎牛血清    WI-38    上皮细胞    人    胚胎肺    BME, 10% 胎牛血清    WISH    上皮细胞    人    羊膜    BME, 10% 胎牛血清    WS1    人    胚胎皮肤    MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA    XC    上皮细胞    大鼠    肉瘤    MEM, 10% 胎牛血清 和NEAA    Y-1    上皮细胞    小鼠    肾上腺瘤    F-10, 15% 马血清和 2.5% 胎牛血清    2、为什么要热灭活血清?加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。3、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。4、GlutaMAX-I是什么?培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定?GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。5、为什么培养基中可以省去加酚红?酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。6、如何用台盼兰计数活细胞?用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。7、如何消除组织培养的污染?当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。① 在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。② 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。③ 每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。④ 确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。⑤ 在无抗生素的培养基中培养细胞一代。⑥ 重复步骤4。⑦ 在无抗生素的培养基中培养4-6代，确定污染是否以已被消除。8、培养基中丙酮酸钠的作用是什么?丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。9、为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?GIBICO的胎牛血清 没有预老化，储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在-20℃储存胎牛血清，避免反复冻融。10、目录上说，Hank’s 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么?Hank’s 平衡盐溶液(HBS)和Earle’s平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别?HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2 培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。11、Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差别?Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：End-Point Determination of Endotoxin Content噬菌体检验生物化学检测激素的检测血红蛋白检测Sf9 细胞生长促进及方法学检测12、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗?使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么?二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。13、制备 lipid-DNA的方法会影响转染效率吗?是的。对于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀释试剂在100μl OPTI-MEM中，稀释DNA在100μl OPTI-MEM中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基(800μl)。(注意以上是35mm培养皿使用体积)。对于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA应该在与脂质体混合之前首先与Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合DNA和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。对于每一种脂质体的详细的信息可以参考产品说明书。14、我使用SF900 Ⅱ时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好?如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清(少于1%)，让血清给蛋白酶提供作用底物。15、如何检测内毒素(热源)水平?LAL(Limulus Amebocyte Lysate)试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。Levin和Bang 发现细菌可引起鲎(Limulus polyphemus)血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统(丝氨酸蛋白酶级联反应系统)，通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，LAL中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。LAL试剂缓冲的鲎(血细胞)裂解物。胎牛血清的内毒素检测是在Grand Island，按照手册上Gel-clot 方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。(通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与LAL反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。)16、我可以使用固体形式的Murashige Skog 培养基吗?如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免MS培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到MS培养基中。17、20℃下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗?对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。下表列出温度改变10℃时，PH值的变化情况。例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液，40℃时PH值为 7.4-(2x0.310)=6.78缓冲系统pKa/20℃[Delta]pKa/10℃Mes    6.15    -0.110    Ada    6.60    -0.110    Pipes    6.80    -0.085    Aces    6.90    -0.200    Bes    7.15    -0.160    Mops    7.20    -0.013    Tes    7.50    -0.200    Hepes    7.55    -0.140    Tricine    8.15    -0.210    Tris    8.30    -0.310    Bicine    8.35    -0.180    Glycylglycine    8.40    -0.280    18、室温下(25℃)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少?缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的PH值。4℃25℃37℃8.1    7.5    7.2    8.2    7.6    7.3    8.3    7.7    7.4    8.4    7.8    7.5    8.5    7.9    7.6    8.6    8.0    7.7    8.7    8.1    7.8    8.8    8.2    7.9    8.9    8.3    8.0    9.0    8.4    8.1    9.1    8.5    8.2    9.2    8.6    8.3    9.3    8.7    8.4    9.4    8.8    8.5    19、昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少?生长培养基的PH值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.0-6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是 345-380mOsm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。20、High Five细胞有任何其它名称吗?High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。21、PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之间有什么差别?PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白质的单克隆抗体生产培养基。如果作为杂交瘤生产培养基使用，PFHM-II可能需要补充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM即是杂交瘤生产培养基，也是单克隆抗体生产培养基。它包含低水平的蛋白质。22、在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少?High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。23、High Five细胞用多大的密度冻存?3.0x106 cells/ml24、在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么?对我的细胞有害吗?可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。25、如何从T25瓶中转移sf9细胞?能用胰蛋白酶消化吗?我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生活力最高。正如手册上所显示，通过使用巴氏德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：① 去除培养基。② 用2ml 1xPBS(足以覆盖细胞表面)洗涤细胞，去除PBS。③ 加入2ml 1x胰酶EDTA(恰好覆盖细胞表面)。④ 37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。⑤ 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。(培养基中的FBS终止了胰酶的活性。)⑥ 离心(1100rpm)沉淀细胞。去除培养基。⑦ 用新的培养基重新悬浮细胞。传代。26、在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少?为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。27、如何评估ES细胞合格的胎牛血清?使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。相关生长效率分析：当ES细胞以非常低的密度传入包含10%胎牛血清的生长培养基中，检测开始和支持ES细胞克隆的能力。细胞毒分析：当以非常低的密度传入包含30%胎牛血清的生长培养基中，检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。相关形态学和分化分析：检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的，培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。(ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。)经过培养发现，大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。28、在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代?随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗?通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95%的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。