实验步骤
1. 小鼠用pH值7.4,0.1M PBS彻底穿心灌注。
2. 用剪刀去头。
3. 剥开头骨的软组织。
4. 除去下颌骨。
5. 除去头骨延髓到上颌骨之间的组织。
6. 手术剪刀,取出头骨顶部,顺时针方向切割,开始和结束于右后鼓膜钩。
7. 舀出大脑,维持组织的完整性。
8. 立即将脑组织置于预冷的流式细胞术缓冲液中(1%BSA 1mM的EDTA的 pH值7.4 0.1M PBS,50U/ml DNAseI)。如果计划标记神经元,应在缓冲液中添加l-谷氨酸以防止在制备过程中的神经细胞死亡。
9. 用杜蒙5#镊子从大脑的外表面仔细剥离脑膜(硬脑膜、蛛网膜和软脑膜)。
10. 使用手术刀作冠状切口分离大脑和小脑/脑干。
11. 使用镊子分离小脑和脑干,小心剥离出第四脑室脑膜衬砌。
12. 使用手术刀,纵向平分,小心剥离出大脑脉络丛及相关的脑膜组织。
13. 进一步解剖到所需分析的脑区(如海马,大脑皮层等)。
14. 将脑组织转移到15MLTenbroeck homogenizer中,其中含有10毫升冰冷的FACS缓冲液。
15. 轻柔震荡3次破碎组织。
16. 粗匀浆,经过70微米尼龙网状带有塑料柱塞的细胞过滤装置,每柱2次,产生单细胞悬液。
17. 离心细胞,4oC, 1200 转/10min,弃掉上清液,再加上细胞流式细胞仪的缓冲液。
18. 用Miltenyi AutoMACS除去髓磷脂,根据指示髓鞘去除珠。
19. 1× 流式细胞仪缓冲液洗细胞,4oC,1100转/10min,弃掉上清液。细胞重置在100 UL预冷的,细胞流式细胞术的缓冲液中再转至细胞流式细胞仪管中。
20. 把细胞标记上带有抗CD11b,CD45的细胞外的小胶质标记物、可修复的LIVE/DEAD染料或者任何其他所需标记(例如GFAP,NeuN,CD3e等),4度避光反应30min。
21. 洗涤细胞2次,如步骤19所示。
22. 在100-400uL含1%PFA PBS溶液(0.1M,PH=7.4)中重新悬浮细胞。4℃避光存储。
23. 在流式细胞仪检测细胞。
24. 首先用LIVE/DEAD设置gate,选择活细胞,然后依据脉冲宽度与面积比选择线性分布细胞,依据前向散射与侧散射比来消除碎屑。然后依据不同细胞类型的相应标记来获得等效和准确的细胞计数。
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