长期摄入α-亚麻酸对自然衰老大鼠学习记忆能力和阿尔茨海默病样改变的保护作用及机制-沪震生物文献

长期摄入α-亚麻酸对自然衰老大鼠学习记忆能力和阿尔茨海默病样改变的保护作用及机制

高慧

华中科技大学

摘要：第一部分长期α-亚麻酸干预对自然衰老大鼠学习记忆能力的影响目的：衰老是机体不可避免的一种正常而复杂的过程,认知功能减退是其重要标志之一。α-亚麻酸(α-linolenic acid,ala)作为人体必需的一种不饱和脂肪酸,具有良好的神经保护和抗衰老作用。本部分旨在探讨长期ala摄入对自然衰老模型大鼠学习记忆功能的影响。方法：将160只specific-pathogen free(spf)级6月龄雌性sprague-dewley大鼠(体重250-300g)随机分为4组,即老年对照组(aged),高脂对照组(high fat,hf),低剂量亚麻油干预组(l-ala)和高剂量亚麻油干预组 (h-ala).aged组给予ain-93m饲料,hf组给予10%(w/w)猪油高脂饲料；l-ala组给予5%(w/w)猪油高脂饲料和5%(w/w)亚麻油；h-ala组给予10%(w/w)亚麻油,持续喂养12个月。另外选择30只相同来源和相同遗传背景的3月龄雌性sd大鼠作为年轻对照组(young),给予ain-93m饲料喂养1个月。监测各组大鼠每天的摄食量和每周体重,计算食物功效比(food effciency ratio,fer);采用morris水迷宫测试评估老年大鼠(18月龄)和年轻大鼠(4月龄)的空间学习记忆能力；大鼠处死后,称量主要脏器重量、he和尼氏染色检查脑组织病理学改变、气相色谱法分析海马和皮质脂质成分的改变。结果：对4组老年大鼠为期12个月的动态监测显示,hf大鼠体重增量和摄食量均最多,并具有最高的fer(均为p<0.05)；添加ala后,大鼠体重增加减缓,摄食量减少,fer也降低。与young组大鼠相比,aged和hf组大鼠在定位巡航实验中到达平台的潜伏期和路径显著延长(均为p<0.05),在空间探索试验中穿越目标象限的时间和路径均明显减少(均为p<0.05)；ala干预能剂量依赖性地缩短大鼠的潜伏时间,并增加其在目标象限的定位(均为p<0.05)。病理检查显示aged和hf大鼠脑组织内出现明显的组织学异常改变和神经元数目减少,而ala处理能显著减轻衰老和/或高脂引起的上述改变。脂质成分分析显示,与非ala处理组(young、 aged和hf)相比,两ala干预组大鼠皮质和海马区ala及其代谢产物dha和epa含量均较明显增加(均为p<0.05),n-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, pufas)水平上升而n-6 pufas减少,引起(n-6)/(n-3)比值下降,不饱和系数明显升高(p<0.05)。结论：长期膳食ala干预可调节自然衰老大鼠脑内脂肪酸含量,保护神经元,并改善老年学习记忆功能。第二部分长期补充ala活化海马creb信号转导通路增强自然衰老大鼠学习记忆功能的机制研究目的：突触可塑性降低是年龄相关性学习记忆改变的主要机制,环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cyclic amp-response element binding protein, creb)在神经元存活、记忆固化、突触修饰等方面具有关键性的作用。本部分研究旨在探讨膳食ala改善年龄相关性的认知障碍与creb信号通路的关系及其潜在的分子机制。方法：将经过morris水迷宫测试的大鼠断头处死,迅速分离脑皮质和海马组织。应用透射电子显微镜下观察大鼠海马ca1区超微结构的改变；western blot方法和real-time pcr方法检测ala对皮质和海马creb信号转导通路及其上游调节因子细胞外信号相关激酶(extracellular signal-regulated kinase, erk)、蛋白激酶b(protein kinase b, pkb/akt)、蛋白激酶a(protein kinase a, pka)和钙调蛋白激酶ⅳ (calcium calmodulin kinase iv, camkiv)的表达。结果：神经元超微结构观察结果显示,aged和hf组大鼠与young组相比,神经元内突触数明显减少(均为p<0.05),脂褐素沉积明显,伴有突触后致密物降低和突触间隙的宽度增加(均为p<0.05)：添加ala能显著改善衰老和／或高脂引起的突触结构的异常改变。脑功能蛋白检测结果发现,aged和hf组大鼠较young组海马creb-p表达水平降低,下游脑源性神经营养因子(bdnf)mrna和蛋白表达下降,其高亲和力受体酪氨酸激酶b(tyrosine kinase b, trkb)的磷酸化水平也降低(均为p<0.05);给予ala膳食能够显著增强creb-bdnf-trkb信号通路的表达(均为p<0.05)。皮质相关蛋白和基因表达未受影响(p>0.05)。对活化creb的上游调节因子分析显示,海马erk和akt在各组的磷酸化状态与creb-p一致;而camkiv-p和pka的表达未受影响。结论：衰老和高脂会降低海马creb信号通路的表达,损害衰老大鼠的学习记忆功能；长期膳食ala干预可呈海马依赖性地活化erk和akt介导的信号通路,调节creb活性,增强突触可塑性,从而改善自然衰老模型大鼠的学习记忆能力。第三部分长期补充ala调节perk/eif2a信号转导通路对自然衰老大鼠阿尔茨海默病样改变的保护作用目的：细胞外p-淀粉样蛋白(amyloid-β,aβ聚集沉淀形成的老年斑和细胞内过度磷酸化的tau蛋白形成的神经原纤维缠结作为阿尔茨海默病(alzheimer’s disease,ad)的典型病理特征,也发生于生理性老化的进程中。近来研究发现内质网应激在ad病变早期发生特定的保护作用。本研究旨在验证衰老进程中是否出现ad样病理改变,并在此基础上进一步探讨内质网应激在ala改善ad样病理中的作用机制。方法：将160只spf级6月龄雌性sprague-dewley大鼠(体重250-300g)随机分为4组,即老年对照组(aged),高脂对照组(hf),低剂量亚麻油干预组(l-ala)和高剂量亚麻油干预组(h-ala)。aged组给予ain-93m饲料,hf组给予10%(w/w)猪油高脂饲料；l-ala组给予5%(w/w)猪油高脂饲料和5%(w/w)亚麻油；h-ala组给予10%(w/w)亚麻油,持续喂养12个月。另外选择30只相同来源和相同遗传背景的3月龄雌性sd大鼠作为年轻对照组(young),给予ain-93m饲料喂养1个月。处死大鼠后,制作脑组织切片进行刚果红和硫黄素t染色,观察aβ在脑实质和血管的沉积：酶联免疫吸附试验检测皮质和海马区aβ40和aβ42水平;免疫组织化学法染色检测脑内磷酸化tau蛋白(ps396-tau)水平,观察是否出现了ad样病理改变；western blot方法p-分泌酶(β-site app-cleaving enzyme 1, bace1)对p-淀粉样前体蛋白(amyloid-β precursor protein, app)的剪切,以及tau蛋白的上游调节分子糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase 3β,gsk-3β)的活化；同时,检测er应激和未折叠蛋白反应的蛋白激酶rna样内质网激酶／真核起始因子2α(protein kinase rna-like endoplasmic reticulum kinase/eukaryotic initiation factor 2α,perk/eif2α)信号分支(调控bace1和gsk-3β活化的关键信号转导通路)分子mrna和蛋白的表达水平。结果：与young组大鼠相比,aged和hf组大鼠脑实质和血管内淀粉样斑块阳性染色明显增多(均为p<0.05),并伴有淀粉样血管变性;tau-p的阳性表达显著升高(均为p<0.05),表明自然衰老大鼠出现ad样病理改变：ala干预后能显著减少脑实质和血管中aβ聚集引起的淀粉样蛋白沉积,减轻tau病理。进一步研究发现,长期补充ala通过调节perk/eif2α信号通路,一方面,降低bace1蛋白活性以减少app生成ap；另一方面,抑制gsk-3β的活化而减少tau蛋白的磷酸化。结论：自然衰老进程中脑内出现了ad样病理改变；长期补充ala能够通过抑制er应激和未折叠蛋白反应的perk/eif2α信号转导通路,改善衰老相关的ad样病理学症状。 还原

关键词：衰老; ala; 学习记忆; 脑形态; 脑脂肪酸组成; creb-bdnf-trkb; 突触可塑性; aβ; tau;perk/eif2α信号通路;

基金：国家自然科学；

导师：刘烈刚;

分类号：r151