分光光度法测定湖泊水中叶绿素a含量的研究

叶绿素a的含量是评价水体富营养化水平的重要依据，通过叶绿素a的含量可以估算出水体中浮游植物生物量。浮游植物存量过高会造成水体的透明度降低，阳光难以穿透水面阻碍水体中植物进行光合作用，植物本身的呼吸作用会导致水体中氧气被消耗，所以造成水体局部缺氧，而水体表面的浮游植物通过光合作用又会释放大量氧气，这样会形成水体中缺氧，水面氧气过饱和的情况，水生动物（如鱼类）会因为缺氧而死亡；浮游植物生物量过 高还会造成底层浮游生物堆积，在厌氧条件下分解 发酵产生有害气体和毒素，伤害水生生物[3] ；营养化 程度高的水体中含有大量的硝酸盐和亚硝酸盐，高 含量硝酸盐和亚硝酸盐水体对人类和其他动物饮用 水安全有很大危害。所以，如何快速、准确地检测水 体中叶绿素a含量并对水体中叶绿素a含量进行合理 控制，这对保护水资源、改善水环境尤为重要。

主要仪器材料

玻璃纤维滤膜（孔径：0.45 μm）。

离心管（PTFE材质15 mL）。

研磨珠（材质：氧化锆；规格：5 mm）。

Tiss-24多样品组织研磨机

DT5-1低速台式离心机

可见分光光度计（上海美析仪器有限公司）。

针式滤器（直径：25 mm；孔径：0.45 μm）。

比色皿（1 cm）。

试剂

丙酮：GR

丙酮溶液（配比9+1：90 0 mL丙酮+100 mL 纯水）。

叶绿素a溶液标准物质（含量：100±3% μg/ mL；）

叶绿素a标准中间液：ρ（叶绿素a）=1.00 μg/mL。

移取1.00 mL叶绿素a标准贮备液于100 mL容量瓶中，用丙酮稀释至标线，混匀。

样品

样品的采集

采集分析叶绿素a样品的水样可以使用500 mL的玻璃瓶作为采样瓶，在距离水面0.5 m的地方进行 水样采集，如果水深不足0.5 m时采集距离水面中部 的水样。如果有泥沙和其他杂物时应将水样静止30 min后取水面下5 ㎝的水样作为分析样品。水样采集 完毕宜尽快送实验室。

样品的制备

用量筒准确量取水样100 mL，将水样倒入事先 准备好带滤膜的过滤装置上进行抽滤，注意抽滤时 负压不要过大以免抽破滤膜。待抽滤快结束时用水 清洗抽滤器内壁，抽滤结束后取出滤膜，撕去多余 空白滤膜然后将有抽滤物的部分对折放入离心管 中。在每个离心管中加入一颗研磨珠，将抽滤物和 研磨珠压至离心管底部，用分液器在每支离心管中 定量加入丙酮溶液10 mL盖上盖子，将离心管移至 多样品组织研磨机上充分研磨5 min。取出离心管 移至离心机以转速3000 r/min的速度离心10 min，取 出离心管用纸包好放入0~4℃的冰箱中避光浸泡提 取2 h。以实验室用水代替样品做空白实验。

分析

打开分光光度计电源并预热15 min,以丙酮溶 液进行仪器调零。用针式滤器将浸泡提取好的样品 过滤至比色皿中在波长750 nm、664 nm、647 nm、 630 nm处测量并记录吸光度。波长750 nm处吸光度 测量值应小于0.005，测定值不满足要求时需检查比 色皿中样品是否存在气泡，如有必要进行二次过滤 后测定。

结果计算，按照实验流程首先计算出定容后 提取液中叶绿素a的质量浓度为：

方法注意事项

（1）丙酮溶液的配制要严格按照90 mL丙酮 +10 mL纯水的比例进行配制，否则在测试过程中可 能会造成吸收峰的漂移，影响检测结果的准确性。

（2）叶绿素a见光易分解，实验过程中浸泡提 取要注意避光操作。

（3）抽滤的过程中要避免因为抽滤压力过大 而造成叶绿素a的损失，因为过大的抽滤压力会造 成样品细胞被破坏或穿透滤膜。

（4）为保证浮游植物能够被充分研磨，研磨时间至少应保证5 min以上，研磨充分的样品比较容易 提取和分离。