超微量分光光度计检测方法研究

摘要：超微量分光光度计目前成为现代分子生物实验室常规仪器，广泛应用于生命科学实验室蛋白质组学和基因组学等领域。应用液体的表面张力特性，检测时经上下臂的接触拉出固定的光径，达到快速、微量、高浓度检测吸光度的特点。本文阐述了如何用现有的国家标准物质对超微量分光光度计进行检测，并举例说明对超微量分光光度计透射比、波长和杂散光等主要指标检测方法。最后对超微量分光光度计日常检测过程中可能遇到的问题并对其进行分析。

分光光度计是一类重要的分析仪器，无论在物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学等研究领域 ，还是在化工、医药、环境检测、冶金等现代生产与管理部门 ，紫外可见分光光度计都有广泛而重要的应用。分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器。由于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量样本量很小，于是超微量分光光度计应运而生。

目前超微量分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器，应用液体的表面张力特性，样品体积只需要0.5～2μL，在检测台上，经上下臂的接触拉出固定的光径达到快速、微量、高浓度及不用石英管、毛细管等耗材检测吸光度的特点，被广泛应用于生命科学实验室蛋白质组学和基因组学等领域。

超微量分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成，与传统分光光度计有明显的不同。二者有以下7点区别:

(1)所需样品体积小，仅需0.5～2μL;

(2)不需要比色皿，用移液枪直接将样品滴加到检测平台上，测量时样品自动形成液柱，检测完成后只需用干净的吸水纸将样品从检测平台上擦拭干净即可;

(3)一般具有1mm和0.2mm两个光程(电机控制自动选择)，而传统分光光度计的光程为10mm，分光光度计样品无需稀释，测量范围可达到常规分光光度计的50倍;

(4)氙气闪光灯为灯源，代替了氘灯(紫外)和钨灯(可见)，使用寿命更长;

(5)不需要预热，可随时检测;

(6)显示吸光度值的同时，程序直接给出浓度值(核酸、蛋白和荧光染料);

(7)体积比传统分光光度计小很多(用体积数值表述)。

超微量分光光度计与传统的紫外可见分光光度计工作原理相同，都是根据物质的分子对紫外、可见区辐射(光)的选择性吸收和朗伯－比尔(Lambert－Beer)定律对物质进行定量分析和定性鉴别的仪器。

朗伯 － 比尔定律的数学表达式为:

A = -lg(I/I 0 )= -lgT = klc

式中:A—物质的吸光度;

I 0 —入射的单色光强度;

I—透射的单色光强度;

T—物质的透射比;

k—物质的吸光系数;

l—被分析物质的光程;

c—物质的浓度。

由此可见，单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度(光程)成正比。物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。

现行的紫外可见分光光度计检定依据为 JJG178－2007《紫外、可见、近红外分光光度计》国家计量检定规程。其中规定透射比标准物质:质量分数为 0.06000/1000重铬酸钾的0.001mol/L高氯酸标准溶液。分别在235nm、257nm、313nm、350nm 处测量透射比三次。重铬酸钾标准溶液在相应波长下不同温度的透射比值如表1所示。

超微量分光光度计检测方法

透射比准确度和重复性的测量

分别在 235nm、257nm、313nm、350nm 处，将重铬酸钾标准溶液［紫外分光光度计溶液标准物质 GBW(E)130066］作为样本进行测量。

首先，超微量紫外可见分光光度计结果为吸光度值，然而紫外分光光度计溶液标准物质(重铬酸钾标准溶液)证书的特性量值用透射比表示。其次，超微量紫外可见分光光度计光径为1mm或0.2mm，和紫外分光光度计溶液标准物质内径为10nm的标准石英吸收池定值条件并不一致。这样就需要对所测出的结果进行数据处理。

由朗伯－比尔定律 A = klc可知，被测物质的光程和吸光度值成正比，可将超微量分光光度计波长为313nm时，光径为1mm的吸光度值0. 030，扩大10倍，转化成光径为10mm的吸光度值为0.300。同理，光径为 0. 2mm的吸光度值0. 006，扩大50倍，转化成光径10mm的吸光度值也为0.300。又根据朗伯－比尔定律 A =-lgT，可得 T =10-A 。超微量分光光度计波长为 313nm 时，T =10-0. 300=50. 1%。

依据 JJG178－2007《紫外、可见、近红外分光光度计》国家计量检定规程要求，分别在 235nm、257nm、313nm、350nm 处测量透射比三次。透射比最大允许误差≤ ±2. 0%，透射比重复性≤1. 0%，符合Ⅳ级仪器指标要求。

波长准确度的测量

扫描氧化钬的光谱曲线，依次查找 200nm～900nm 的指定波长，配合图谱下方的数据列表，找出氧化钬光谱曲线的波峰值(与其对应的则是光谱曲线透射比的波谷值)。

依据 JJG178－2007 规程的计量性能要求，波长在200nm～340nm 区段，最大允许误差≤±2nm，波长在340nm～900nm 区段，最大允许误差≤± 4nm，波长重复性≤1nm，符合Ⅳ级仪器指标要求。

杂散光的测量

测量生化分析仪校准用溶液标准物质(BW2025)中的亚硝酸钠标准溶液(注:溶液浓度为 50g/L) 根据朗伯 － 比尔定律，先将仪器测量的吸光度值转化成光径为 10mm 的吸光度值:A 10nm = 10A 1nm = 1. 412×10 =14. 12。超微量分光光度计波长为 340nm 时杂散光的结果，转化成 T =10－A=10－14. 12=0. 0%。依据 JJG178 －2007 规程的计量性能要求，仪器杂散光(透射比)≤0. 1%，符合Ⅰ级仪器指标要求。

常见超微量分光光度计检测中的问题及分析

超微量分光光度计的零点漂移

用紫外分光光度计标准物质(重铬酸钾标准溶液)检测仪器透射比准确度，分别设置235nm、257nm、313nm、350nm 四点波长，以空白溶液为参比，在对应波长下调零后，用紫外分光标准溶液测量被测仪器的透射比。

测量结果与紫外可见分光光度计标准物质透射比差别较大，且连续测量 3 次，对测量结果的影响不大。

经过测量结果数据分析，仪器经转化后的透射比结果比标准值小，得出吸光度值原始测量结果则比吸光度的标准值大，其中发现吸光度的误差变化成线性，且误差均是 0. 10。

这样将标准空白溶液当成样本，测量空白溶液吸光度值，发现空白溶液的吸光度值为 0. 010(被测仪器的光径为 1mm)。转化成光径为 10mm 的吸光度对应正好也就相差 0. 10。这种方法可以测量出该仪器的零点漂移。把仪器的吸光度的本底减去后符合朗伯 － 比尔定律。

结束语

通过上述的检测方法阐述和问题分析，对判断超微量分光光度计的计量性能有了更加可行的手段和方法。依据 JJG178 － 2007《紫外、可见、近红外分光光度计》中的要求，并没有规定对超微量分光光度计有效的检测方法。因此结合计量部门的实际情况，设计一套有效的检测方法，使得计量标准得到有效的量值传递，也同时解决了超微量分光光度计此前无法量值溯源问题，是值得在今后的工作中加以推广并完善的。