2024/03/14 11:23
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产品配置单:
UL-4000固定波长核酸蛋白浓度检测仪
型号: UL-4000
产地: 浙江
品牌: 美析仪器
¥7万
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美析超微量分光光度计UL-2000
型号: UL-2000
产地: 北京
品牌: 美析仪器
¥11万
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方案详情:
目的:通过超微量紫外扫描与体外生物效应对佛手、香圆、枸橼进行鉴别。方法:通过光学显微镜观察3种药材的粉末,采用超微量紫外扫描获得佛手、香圆、枸橼提取物的最大吸收波长,通过酶标仪检测药材提取物的DPPH自由基清除、乙酰胆碱酯酶抑制和α - 葡萄糖苷酶抑制活性。结果:佛手、香圆、枸橼粉末的显微特征无明显区别,其紫外最大吸收波长分别为323、285、270 nm,三者均无明显的乙酰胆碱酯酶抑制活性,但均有显著的α - 葡萄糖苷酶抑制活性,其中DPPH自由基清除活性可用于香圆与枸橼的区分。结论:超微量紫外扫描结合体外生物效应检测是鉴别佛手、香圆、枸橼的有效方法,且3种药材含有潜在的DPPH自由基清除剂与α - 葡萄糖苷酶抑制剂。
中药鉴定发展趋势是简便微量化和生物效应鉴定。简便性是中药鉴定的基本要求,采用更少的试剂符合环境友好的原则,当前基于紫外光谱的微型化鉴定方法发展迅速,该技术利用中药提取物的紫外光谱特征进行快速、无损的鉴定,极大提高了中药鉴定的效率和准确性,降低了中药鉴定的成本。传统的性状、显微、理化鉴定均与药材的生物活性不直接相关。目前,《中华人民共和国药典》和国家药品监督管理局均提出了中药生物效应鉴定指导原则。国内学者也呼吁要增加中药材的生物效应指标。然而,中药的成分复杂、药理作用机制不明确,给生物效应鉴定带来了一定的困难,绝大多数中药缺乏个体化的生物效应鉴定方法。尽管面临着诸多挑战,但发展中药生物效应鉴定仍是必然趋势。佛手、香圆、枸橼均来源于芸香科、柑橘属,三种植物的果实均可药用。其中,香圆、枸橼的干燥成熟果实为药材香橼的来源。佛手、香圆、枸橼功效相似,均可疏肝理气、化痰。传统的性状鉴定可用于佛手的辨识,但不易区分性状特征相似的香圆和枸橼。由于三种药材亲缘关系相近,其显微特征存在相似性。此外,三种药材均含有橙皮苷、柚皮苷等黄酮类成分,传统的理化鉴定难以实现三者的区分。因此,有必要发展新型有效的鉴别方法用于区别佛手、香圆、枸橼。本研究以同科同属的佛手、香圆、枸橼为研究对象,探索超微量紫外扫描与生物效应检测相结合的中药鉴定方法。该鉴定方法符合简便微量化且体现生物效应发展趋势,可为其他亲缘关系相近的中药鉴别提供参考,对于发展新型中药鉴定策略具有积极意义。
仪器与试剂
BIOBASE - EL 10B型酶标仪;
UL - 5000型超微量紫外分光光度计(上海美析仪器有限公司,型号:UL - 5000);
F - 010S型超声波清洗器(深圳市钰洁清洗设备有限公司,型号:F - 010S);
力辰 101 型烘箱、力辰 LC -Vortex - P2 型点动混匀仪、FA1004 型电子分析天平(上海力辰仪器科技有限公司,型号:FA1004)。
佛手、香圆、枸橼果实(批号:2021113001,浙江金华、江苏镇江、云南大理);
1,1 - 二苯基 - 2 - 苦基肼、碘化乙酰硫代胆碱、5,5'- 二硫代双(2-硝基苯甲酸)[批号:C10636623、H1803032、E1922062,阿拉丁试剂(上海)有限公司];
4 - 硝基苯基 - α - D - 吡喃葡萄糖苷、乙酰胆碱酯酶(批号:J29GS156009、Y23O11Q128361,上海源叶生物科技有限公司);
α - 葡萄糖苷酶(批号:20200525001,上海鼓臣生物技术有限公司)。
实验方法
样品溶液的制备:分别称取佛手、香圆、枸橼粉末0. 1 g,精密称定,置于离心管中,加甲醇10 mL,超声提取30 min,摇匀,采用针式过滤器过滤,即得。
粉末显微鉴定:取佛手、香圆、枸橼粉末少量,置于载玻片上,滴加饱和水合氯醛2滴,酒精灯加热至透化,滴加稀甘油2滴,加盖玻片置于光学显微镜下观察。
超微量紫外扫描:启动超微量紫外分光光度计,用移液枪吸5 μL水清洗3次,再吸1 μL甲醇作为空白对照。分别吸取1 μL佛手、香圆、枸橼提取物进行检测,确定最大吸收波长。
体外生物活性检测:DPPH自由基清除活性、乙酰胆碱酯酶抑制活性、α - 葡萄糖苷酶抑制活性的步骤以及阳性对照参考本研究组研究成果。
DPPH自由基清除活性:分别取佛手、香橼、枸橼溶液300μL于不同离心管中作为第1个浓度点,再取300μL溶液于300μL甲醇中作为第2个浓度点,依次对半稀释作为梯度浓度。样品孔先滴加50μL样品,再滴加150 μL DPPH溶液,每个浓度设 4 个复孔。空白孔加入 50 μL 甲醇、150 μL DPPH 溶液,进板分析。所得数据用软件GraphPadPrism分析处理 。
乙酰胆碱酯酶活性:配制梯度浓度的佛手、香橼、枸橼溶液作为样品。每孔加110μLPBS溶液(pH值8),再滴加20 μL样品,每个浓度设4个复孔。对照组加入110 μL PBS(pH值8)、20 μL空白溶液。用排枪滴加20 μL的酶液(0. 3 U/mL),孵育5 min后使用排枪50 μL碘化乙酰硫代胆碱与5,5' - 二硫代双(2 - 硝基苯甲酸)的混合溶液,进板分析,在405 nm下读取吸光度,每个样品板共计20 min。所得数据用软件GraphPadPrism分析处理。
α - 葡萄糖苷酶抑制活性:向样品孔滴加30 μL样品,然后滴加30 μL α - 葡萄糖苷酶溶液(0. 8 U/mL),每个浓度设4个复孔。空白对照加入30μL溶剂、30 μL酶溶液。孵育30 min后用排枪加入90μLPNPG溶液,进板分析。所得数据用软件GraphPadPrism分析处理。
结果
外观鉴定:佛手外观形似手指,成熟果实表面黄色;香圆与枸橼的形状均为类圆形或椭圆形,成熟果实表面黄色,未成熟部分为绿色。
显微鉴定:三种药材的粉末显微特征。佛手、香圆、枸橼的导管均成束且多为螺纹导管,中果皮薄壁组织为不规则的多边形,边缘不均匀增厚。整体而言,佛手、香圆、枸橼的粉末显微特征相似,不易区分。
紫外最大吸收波长鉴定:佛手、香圆、枸橼提取物的超微量紫外波长扫描图。三种药材的最大吸收波长分别为 323、285、270 nm,最大吸收波长具有显著差异。因此,可通过最大吸收波长区分佛手、香圆、枸橼。而且,超微量紫外扫描法操作简单,所需要的样品量为微升级别,符合中药鉴定简便微型化的要求。
体外生物活性鉴定:佛手、香圆、枸橼提取物的 DPPH 自由基清除活性、乙酰胆碱酯酶的抑制活性、α - 葡萄糖苷酶抑制活性。佛手、香圆的自由基清除率超过了50%,其IC 50 值分别为1. 56、1.93 mg/mL,枸橼的DPPH自由基清除活性低于佛手、香圆。考虑到香圆和枸橼具有相似的性状特征,DPPH自由基清除活性可用于二者的区分。3种药材均无明显的乙酰胆碱酯酶抑制活性。佛手、香圆、枸橼均有较强的 α - 葡萄糖苷酶抑制活性,其IC 50 值分别为0. 10、0. 12、0. 09 mg/mL,表明3种药材中含有潜在的α - 葡萄糖苷酶抑制剂。
讨论
佛手、香圆、枸橼具有很多共性特征:三者亲缘关系接近,均来源于芸香科柑橘属;三者功效相近,均可疏肝理气、化痰;三者的主要成分均为黄酮类。除了药用,佛手、香圆、枸橼还常用作保健茶,具有较大的市场需求量。在商品规格中,3种药材常切丝用,由于三者在多个方面存在共性特征,这为药材鉴别带来了一定的挑战。针对该问题,本研究采用传统的显微鉴定方法发现,3种药材均具有相似的导管、中果皮薄壁组织,结果显示三者难以区分。基于此种情况,本文提出一种超微量紫外扫描结合体外生物效应检测的整合策略,以实现亲缘关系相近中药的准确鉴别。结果显示,3种药材的提取物在最大吸收波长处具有明显区别。在体外生物活性检测方面,3种药材在自由基清除方面具有差异,可用于区分外观相似的枸橼与香圆。此外,3种药材均具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性,表明药材中可能含有抑制α - 葡萄糖苷酶的先导化合物。佛手、香圆、枸橼用作保健茶可能与其潜在的降糖作用有关。
结论
超微量紫外扫描结合体外生物效应检测是鉴别佛手、香圆、枸橼的有效方法。该方法符合当前中药鉴定简便微量化、体现生物效应的发展趋势。3种药材含有潜在的自由基清除剂与α - 葡萄糖苷酶抑制剂,可为后续先导化合物的发现奠定前期基础。
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