血清IgG的分离制备实验—盐析法

实验原理

IgG是免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称IgG）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s。IgG是动物和人体血浆的重要成分之一。血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。

盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in）。而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析‘（Salting out）。这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。但当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。

盐析法是1878年Hammarster首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol/L，即767g/L，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L。而且硫酸铵价廉易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。因此，现在所指的盐析法实际上多为硫酸铵盐析法。

用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般以饱和度来表示。实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1饱和度的百分之几，即秒为该蛋白盐析的饱和度。饱和度可以根据情况用下述两种方法计算。

1．饱和硫酸铵溶液法 

在蛋白质溶液的总体不大，要求达到饱和度在50%以下时，可选用此方法。在已知盐析出某各蛋白质成分所要过到饱和度时，可按下列公式计算出应加入饱和硫酸铵溶液的数量：

式中：V0——蛋白质溶液的原始体积；

C2——所要达到硫酸铵饱和度；

C1——原来溶液的硫酸铵饱和度；

V——应加入饱和硫酸铵溶液的体积。

将计算所得体积的饱和硫酸铵溶液加入到混合蛋白质溶液中，即可达到盐析的目的。严格讲，混合两不同溶液时，混合后的总体积并不等于混合前两种溶液体积之和，而上式中是按相等于计算的，所以会产生误差。但实验证明所造成的误差一般小于20%，故可忽略不计。

2．固体硫酸铵法 

所需达到的饱和度较高，而蛋白质溶液的体积又不能再过分增大时，采用直接加入固体硫酸铵的方法。欲达到某到饱和度可按下列公式计算出应加入固体硫酸铵的数量：

X是将1L饱和度为C1溶液提高到饱和度为C2时，需要加入固体硫酸铵的重量（g）。G和A为常数，数值与温度有关。现在已将达到各种饱和度所需固体硫酸铵的数量列成表，使用时不需计算可直接从表中查出。

市售固体硫酸铵中一般残留有硫酸，所以制备的饱和硫酸铵溶液的PH常在4.5 ~5.5之间，作用之前应该用氢氧化铵调节，使其PH为7。用固体硫酸铵盐析时，蛋白质应溶解于具有一定缓冲能力的溶液中，并且在加入硫酸铵中还含有一些重金属离子，用量大时易使蛋白质变性，在这种情况下可加入一些EDTA等螯合剂以螯合这些金属离子。

硫酸铵盐析法可使蛋白质的纯度提高约5倍，而且可以除去DNA，RNA等。但盐析后的蛋白质中仍含有一些杂蛋白，所以盐析产生的产品为粗分离产品需要进一步纯化。本实验中利用离子交换层析法纯化。在离子交换层析之前，由于盐析所得的蛋白质中含有大量硫酸铵，将影响离子交换层析。所以，在层析之前需要“脱盐”。“脱盐”有凝胶过滤法和透析法，本实验将采用凝胶过滤法。

操作方法

（1）在1支离心管中加入5ml血清和5ml 0.01mol/L，PH7.0 磷酸盐缓冲液，混匀。用皮头滴管吸取饱和硫酸铵溶液，边滴加边搅拌于血浆溶液中，使溶液的最终饱和度为20%（应加入饱和硫酸铵溶液多少毫升？），用滴管边加边搅拌，是为防止饱和硫酸铵1次性加入或搅拌不均匀造成局部过饱和的现象，使盐析达不到预期的饱和度，得不到目的蛋白质。搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。加完后应在4℃放置15min，使之充分盐析（蛋白质样品量大时，应放置过夜）。然后以3000r/min离心10min。弃去沉淀（沉淀为纤维蛋白原），在上清液中为清蛋白、球蛋白。

（2）量取上清液的体积，置于另一离心管中，用滴管继续在上清液中滴加饱和硫酸铵溶液，使溶液的饱和度达到50%（应加饱和硫酸铵溶液多少毫升？）。加完后在4℃放15min，以3000r/min离心10min，清蛋白在上清液中，沉淀为球蛋白。弃去上清液，留下沉淀部分。

（3）将所得的沉淀再溶于5ml0.01mol/L，PH7.0磷酸盐缓冲液中。滴加饱和硫酸铵溶液，使溶液的饱和度达35%（应加入饱和硫酸铵溶液多少毫升？）。加完后4℃放置20min，以3000r/min离心15min，a，b球蛋白在上清液中，沉淀为IgG。弃去上清液，即获得粗制的IgG沉淀。

为了进一步化，操作（3）可得1~2次。将获得的粗IgG沉淀溶解于2ml0.0175mol/L，PH6.7磷酸盐缓冲液中备用。

试剂和器材

（1）饱和硫酸铵溶液：取化学纯（NH4）2SO4800g，加蒸馏水1000ml，不断搅拌下加热至50~60℃，并保持数分钟，趁热过滤，滤液在室温中过夜，有结晶析出，即达到100%饱和度，作用时用浓NH4OH调至PH7.0。

（2）0.01mol/L，PH7.0，磷酸盐缓冲溶液：取0.2mol/L Na2HPO4溶液61.0ml，0.2 mol/L Na2HPO4溶液39.0ml，混合，用酸度计检查PH应为7.0。取该混合液50ml，加入7.5gNaCl，用蒸馏水1000ml。

（3）0.0175mol/L，PH.7，磷酸盐缓冲溶液：取0.2 mol/L Na2HPO4溶液43.5ml与0.2 mol/L Na2HPO4溶液56.5ml相混合，用酸度计检查PH应为6.7。取该混合液87.5ml，用蒸馏水稀释至1000ml。