细胞增殖检测——MTT法

细胞增殖是指细胞在周期调控的因子下，通过DNA复制等反应，完成细胞分裂的过程。增殖检测一般是分析分裂中的细胞数量的变化，进而反应细胞的生长状态及活性，目前广泛应用于肿瘤生物学，分子生物学，药代动力学等领域。

检测细胞增殖方法

检测细胞增殖的方法很多，目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。

一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。例如：Ki67细胞增殖检测；BrdU细胞增殖检测；EdU细胞增殖检测。

另一种是间接的方法，即细胞活力检测方法，通过检测样品中健康细胞数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测方法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。例如：MTT法、CCK8试剂盒法，下面就来介绍一下MTT法。

MTT是什么？

MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料，CAS No. : 298-93-1

MTT原理

检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臢并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臢，用酶标仪在490nm波长处（英文说明书写的是570nm）测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

MTT实验步骤

1、接种细胞

用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。

2、培养细胞

同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3、呈色

培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

4、比色

选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

MTT实验注意事项

1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰：一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

MTT实验吸光度最hou要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，

IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！