Life Technologies产品介绍之细胞自噬
Life Technologies提供了用于细胞功能和健康检测的各种试剂。其中许多分析以荧光或比色法为基础,具有灵敏性、便利性和安全性。这些产品已经过多种仪器平台验证,包括显微镜、流式细胞仪、酶标仪和高内涵筛选,能够实现各种细胞功能的分析:
细胞活性和细胞毒性
细胞增殖和细胞周期
细胞凋亡
自噬
氧化应激
内吞作用和吞噬作用
细胞内离子
自噬是凋亡之外的第二种程序性细胞死亡方式,是进化过程中保留下来的高度保守的自我保护机制,参与自噬的基因从单细胞的酵母到植物、脊椎动物和人中均较为保守。自噬在机体稳定、组织重塑、细胞发育及内环境稳态、生物合成以及环境的适应方面等都发挥着十分重要的作用。
通常自噬的形成主要分为4个步骤,如图1所示:
(1)自噬的诱导:细胞在接受自噬诱导信号后,在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜样结构,然后不断向两边延伸,成扁平状,称为Phagophore(相当于自噬前体),是自噬发生的标志之一。
(2)自噬体的形成:Phagophore不断延伸,将胞浆中的成分包括细胞器及营养成分(正常或异常的)揽入膜内,然后形成密闭的球状结构,称为自噬体(Autophagosome),是自噬形成的标志之一。
(3)自噬溶酶体的形成:多个溶酶体与自噬体融合形成自噬溶酶体(Autolysosome)。在自噬体和溶酶体结合时,其外层膜与溶酶体膜融合,内层膜断裂,释放被包裹的物质,
(4)自噬体内容物的降解:释放的物质在溶酶体/液泡内部酸性水解酶的作用下发生降解,产物(如氨基酸、核苷、单糖、脂肪酸等)被送到胞浆中,供细胞重新利用,而残渣被排出细胞或滞留在胞浆中。
一、通过LC3B和p62进行自噬示踪
在自噬早期,Phagophore形成时会招募LC3B,可作为自噬膜的标志,并检测自噬的发展过程。Life Technologies的Premo?自噬传感器融合了LC3B荧光蛋白嵌合体(GFP或RFP)和BacMam技术的转导效率,可明确显示活细胞内的LC3B蛋白。该试剂还可耐受甲醛固定,因而可用于固定细胞分析,满足抗体多重实验的要求,也更适于HCS分析。要对自噬过程进行成像,只需将BacMam LC3-FP加入细胞,孵育过夜使蛋白表达即可。
用于自噬作用检测的LC3B抗体试剂盒包含高度特异性的兔抗LC3B 多克隆抗体,经验证可用于荧光显微镜和高内涵成像。它还含有一种可诱导自噬体的对照化合物——采用该化合物处理后,溶酶体pH升高,正常的自噬性流动受到干扰,导致自噬体聚集。
p62是自噬降解的细胞组分包括泛素化蛋白聚集体的受体,与泛素及LC3结合,因此可示踪蛋白降解。Life Technologies可提供转导效率高、示踪活细胞中p62的试剂,并能兼容细胞标记抗体进行多色分析。
左图示:U2OS细胞转导Premo? Autophagy Sensor LC3B-RFP(红色)和CellLight? Tubulin-GFP(绿色)。U2OS细胞转导Premo? Autophagy Sensor LC3B-RFP(红色)和CellLight? Tubulin-GFP(绿色),培养过夜。随后加入60 μM氯喹培养过夜。细胞经1 μg/ml Hoeschst 33342(蓝色)复染后观察。
上图示: Premo? Autophagy Sensor Tandem RFP-GFP-LC3B可用于区分酸性和中心LC3B阳性囊泡。每个HeLa细胞中转导入40个Premo? Autophagy Sensor,培养24h,随后加入载体、90 μM氯喹或200 μM亮抑酶肽A孵育24h。氯喹通过中和溶酶体pH值阻断自噬,因此可同时观察到GFP和RFP。而亮抑酶肽A不通过改变溶酶体pH值来阻断自噬,因此在酸性环境下GFP荧光消失,仅能观察到红色荧光。
左图示:使用Premo? Autophagy Sensor GFP-p62 Kit对p62阳性囊泡沿着微管运动进行成像。A549细胞转导入Premo? Autophagy Sensor GFP-p62和CellLight? Tubulin-RFP培养24h。加入终浓度60 μM的氯喹培养16h。最后标记Hoeschst 33342染色。
产品列表
货号 | 产品名称 | 应用 | 荧光素 | Ex/Em(nm) |
P36235 | Premo? Autophagy Sensor LC3B-GFP, BacMam 2.0 | HCS;IF | GFP | 485/520 |
P36236 | Premo? Autophagy Sensor LC3B-RFP, BacMam 2.0 | HCS;IF | RFP | 555/584 |
L10382 | LC3B Antibody Kit for Autophagy | HCS;IF | N/A | N/A |
A14070 | Premo? Autophagy Tb/GFP TR-FRET LC3B Expression Kit | HCS | N/A | N/A |
P36239 | Premo? Autophagy Tandem Sensor RFP-GFP-LC3B Kit | IF | GFP | 485/520 |
RFP | 555/584 | |||
P36240 | Premo? Autophagy Sensor GFP-p62 Kit | IF | GFP | 485/520 |
P36241 | Premo? Autophagy Sensor RFP-p62 Kit | IF | RFP | 555/584 |
二、溶酶体
溶酶体膜标志可作为追踪自噬体融合的工具。Life Technologies提供含红色或绿色荧光蛋白的CellLight?试剂用于溶酶体膜的定位和示踪,并与其他荧光染料或蛋白兼容操作。另有溶酶体探针试剂,对酸性细胞器具有高度选择性,微量即可有效地标记活细胞,简单高效特异。
上图 使用CellLight?试剂进行活细胞成像。人主动脉平滑肌细胞转导CellLight? Lysosomes-RFP、CellLight? MAP4-GFP和Hoechst 33342。
上图 牛肺动脉内皮细胞经MitoFluor? Far Red 680, LysoTracker? Green DND-26和Hoechst 33342染色成像,分别染色线粒体、溶酶体和细胞核。
产品列表
货号 | 产品名称 | 应用 | Ex/Em(nm) | 规格 |
C10507 | CellLight? Lysosomes-GFP, BacMam 2.0 | FCM;IF | 485/520 | 100 μl |
C10596 | CellLight? Lysosomes-GFP, BacMam 2.0 | FCM;IF | 485/520 | 1 ml |
C10504 | CellLight? Lysosomes-RFP, BacMam 2.0 | FCM;IF | 555/584 | 100 μl |
C10597 | CellLight? Lysosomes-RFP, BacMam 2.0 | FCM;IF | 555/584 | 1 ml |
L7525 | LysoTracker? Blue DND-22 | IF | 373/422 | 20 x 50 μl |
L7526 | LysoTracker? Green DND-26 | IF | 504/511 | 20 x 50 μl |
L7528 | LysoTracker? Red DND-99 | IF | 577/590 | 20 x 50 μl |
L7533 | LysoSensor? Blue DND-167 | IF | 373/425 | 20 x 50 μl |
L7534 | LysoSensor? Green DND-153 | IF | 442/505 | 20 x 50 μl |
L7535 | LysoSensor? Green DND-189 | IF | 443/505 | 20 x 50 μl |
L7545 | LysoSensor? Yellow/Blue DND-160 | IF | 329/440 | 20 x 50 μl |
L12491 | LysoTracker? Yellow HCK-123 | IF | 465/535 | 20 x 50 μl |
L12492 | LysoTracker? Deep Red | IF | 647/668 | 5 x 50 μl |
阅读原文:http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014040013.html
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