Life Technologies细胞自噬产品

Life Technologies产品介绍之细胞自噬

Life Technologies提供了用于细胞功能和健康检测的各种试剂。其中许多分析以荧光或比色法为基础，具有灵敏性、便利性和安全性。这些产品已经过多种仪器平台验证，包括显微镜、流式细胞仪、酶标仪和高内涵筛选，能够实现各种细胞功能的分析：

• 细胞活性和细胞毒性

• 细胞增殖和细胞周期

• 细胞凋亡

• 自噬

• 氧化应激

• 内吞作用和吞噬作用

• 细胞内离子

　　自噬是凋亡之外的第二种程序性细胞死亡方式，是进化过程中保留下来的高度保守的自我保护机制，参与自噬的基因从单细胞的酵母到植物、脊椎动物和人中均较为保守。自噬在机体稳定、组织重塑、细胞发育及内环境稳态、生物合成以及环境的适应方面等都发挥着十分重要的作用。

通常自噬的形成主要分为4个步骤，如图1所示：

• (1)自噬的诱导：细胞在接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜样结构，然后不断向两边延伸，成扁平状，称为Phagophore(相当于自噬前体)，是自噬发生的标志之一。

• (2)自噬体的形成：Phagophore不断延伸，将胞浆中的成分包括细胞器及营养成分(正常或异常的)揽入膜内，然后形成密闭的球状结构，称为自噬体(Autophagosome)，是自噬形成的标志之一。

• (3)自噬溶酶体的形成：多个溶酶体与自噬体融合形成自噬溶酶体(Autolysosome)。在自噬体和溶酶体结合时，其外层膜与溶酶体膜融合，内层膜断裂，释放被包裹的物质，

• (4)自噬体内容物的降解：释放的物质在溶酶体/液泡内部酸性水解酶的作用下发生降解，产物(如氨基酸、核苷、单糖、脂肪酸等）被送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣被排出细胞或滞留在胞浆中。

一、通过LC3B和p62进行自噬示踪

 在自噬早期，Phagophore形成时会招募LC3B，可作为自噬膜的标志，并检测自噬的发展过程。Life Technologies的Premo?自噬传感器融合了LC3B荧光蛋白嵌合体(GFP或RFP)和BacMam技术的转导效率，可明确显示活细胞内的LC3B蛋白。该试剂还可耐受甲醛固定，因而可用于固定细胞分析，满足抗体多重实验的要求，也更适于HCS分析。要对自噬过程进行成像，只需将BacMam LC3-FP加入细胞，孵育过夜使蛋白表达即可。

 用于自噬作用检测的LC3B抗体试剂盒包含高度特异性的兔抗LC3B 多克隆抗体，经验证可用于荧光显微镜和高内涵成像。它还含有一种可诱导自噬体的对照化合物——采用该化合物处理后，溶酶体pH升高，正常的自噬性流动受到干扰，导致自噬体聚集。　

 p62是自噬降解的细胞组分包括泛素化蛋白聚集体的受体，与泛素及LC3结合，因此可示踪蛋白降解。Life Technologies可提供转导效率高、示踪活细胞中p62的试剂，并能兼容细胞标记抗体进行多色分析。

左图示：U2OS细胞转导Premo? Autophagy Sensor LC3B-RFP(红色)和CellLight? Tubulin-GFP(绿色)。U2OS细胞转导Premo? Autophagy Sensor LC3B-RFP(红色)和CellLight? Tubulin-GFP(绿色)，培养过夜。随后加入60 μM氯喹培养过夜。细胞经1 μg/ml Hoeschst 33342(蓝色)复染后观察。

上图示： Premo? Autophagy Sensor Tandem RFP-GFP-LC3B可用于区分酸性和中心LC3B阳性囊泡。每个HeLa细胞中转导入40个Premo? Autophagy Sensor，培养24h，随后加入载体、90 μM氯喹或200 μM亮抑酶肽A孵育24h。氯喹通过中和溶酶体pH值阻断自噬，因此可同时观察到GFP和RFP。而亮抑酶肽A不通过改变溶酶体pH值来阻断自噬，因此在酸性环境下GFP荧光消失，仅能观察到红色荧光。

左图示：使用Premo? Autophagy Sensor GFP-p62 Kit对p62阳性囊泡沿着微管运动进行成像。A549细胞转导入Premo? Autophagy Sensor GFP-p62和CellLight? Tubulin-RFP培养24h。加入终浓度60 μM的氯喹培养16h。最后标记Hoeschst 33342染色。

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二、溶酶体

溶酶体膜标志可作为追踪自噬体融合的工具。Life Technologies提供含红色或绿色荧光蛋白的CellLight?试剂用于溶酶体膜的定位和示踪，并与其他荧光染料或蛋白兼容操作。另有溶酶体探针试剂，对酸性细胞器具有高度选择性，微量即可有效地标记活细胞，简单高效特异。

上图 使用CellLight?试剂进行活细胞成像。人主动脉平滑肌细胞转导CellLight? Lysosomes-RFP、CellLight? MAP4-GFP和Hoechst 33342。

上图 牛肺动脉内皮细胞经MitoFluor? Far Red 680, LysoTracker? Green DND-26和Hoechst 33342染色成像，分别染色线粒体、溶酶体和细胞核。

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