应用指南 | 绿茶中 EGCG 的提取、鉴定及纯化研究

应用指南 | 绿茶中 EGCG 的提取、鉴定及纯化研究

    茶文化距今已经有一千多年的历史，是广受欢迎的饮品之一。绿茶中富含对健康有益的物质，比如茶多酚、维生素C、氨基酸等等。其中茶多酚是一类具有强抗氧化能力的天然化合物，据报道其在预防癌症和抗肥胖方面有积极作用。

    本应用案例通过 Interchim puriFlash 5.250 制备液相色谱法（Prep-LC）成功开发出分离和纯化绿茶儿茶素的方法，并通过 HPLC-UV-CMS（Advion Interchim Scientific） 方法进行化合物质谱确认和纯度分析。

图1 puriFlash 5.250 纯化系统 & expression CMS小型台式质谱仪 & puriFlash Active Splitter 质谱接口

绿茶提取物介绍

01 儿茶素化合物介绍

    干绿茶通常含有10-30% 的多酚（干重），儿茶素是主要的茶多酚，包括(−)-epigallocatechin(EGC),(−)-epigallocatechin-3-gallate(EGCG),(−)-epicatechin-3-gallate (ECG) 和(−)-gallocatechin gallate (GCG)。EGCG是最丰富和生物活性的儿茶素。从生茶提取物中分离纯化儿茶素可以极大地提高儿茶素的市场利用率和价值。

图2 绿茶中的主要儿茶酚

02 绿茶多酚提取

    用香料研磨机研磨干绿茶叶，称取 14g 放入 500mL 的清洁烧瓶中，加入 300mL 水，在 40°C 下搅拌 60min。然后用滤纸过滤溶液，与乙酸乙酯（1:2，v/v）混合，涡旋 2min。将有机层倒入干净的旋蒸瓶中，并使用旋转蒸发器进行干燥。然后将干提取物溶解在 7.5mL 水中，并在进一步处理之前用 0.2µm 过滤器过滤。

绿茶提取物的 HPLC-UV/CMS 分析

    采用 HPLC-UV/CMS 法检测绿茶提取物中的 EGC、EGCG、GCG、EC 和 ECG。

图3 绿茶提取物的 HPLC-UV 色谱图。CMS 数据用于化合物确认(数据未显示)。

03 绿茶的分离纯化

    在 Interchim puriFlash 5.250 Prep LC/Flash 系统上进行绿茶提取物纯化，溶剂和分离方法的详细信息如下表所示。

图4 茶叶提取物的 Prep LC/Flash-UV 色谱图（50 mg）

    茶叶提取物的典型 Prep LC-UV 色谱图如图 4 所示。收集到的每个馏分通过HPLC-UV/MS 进行质谱鉴定分析。

    HPLC-UV/MS 分析表明，馏分 1.3(图 4A )含有纯度为 99.9% 的 EGC(图4B)。质谱分析也证实了在馏分 1.3 中检测到去质子化的 EGC，m/z为304.9。

图5 A)茶叶提取物(50 mg)的 PrepLC-UV 色谱图;(B) 馏分 1.3 的 HPLC-UV (275nm)色谱图;(C)馏分1.3中 EC 的质谱图。

    馏分1.6(图5A)的 EGCG 纯度为 99.9%(图5B)。在 ESI-HPLC-CMS 负离子模式中检测到去质子化的 EGCG, m/z为 457.1(图5C)。在 45v 的源内 CID 下，m/z 305 和 m/z 168.9 处检测到主要碎片峰(图5D)。

图6 （A） 茶提取物（50 mg）的 PrepLC-UV 色谱图；（B）馏分 1.6 的 HPLC-UV（275nm）色谱图；（C） 馏分 1.6 中 EGCG 的质谱图；（D） 馏分 1.6 中 EGCG 45V 时源内 CID 的质谱图。

    通过图 7 所示的 HPLC-UV/CMS 数据分析，确定了在馏分 1.8 中 GCG 的纯度为 95.8%，EGCG 为 4.1%。在馏分 1.9 中，GCG 的纯度为 98.8%，EC为 1.1%。

图7 (A)茶叶提取物(50 mg)的 PrepLC-UV 色谱图;(B) 馏分 1.8 的 HPLC-UV (275nm)色谱图;(C)馏分 1.9 的 HPLC-UV (275 nm)色谱图。

    该数据证实馏分 1.13 和 1.14 含有纯度为 100% 的 ECG。在 HPLC-CMS 分析中检测到 m/z 为 441.1 的去质子 ECG，源内 CID 也确认 m/z 289.0 和 m/z 168.9 是 ECG 两个主要碎片峰。

图8 (A)茶叶提取物(50 mg)的 PrepLC-UV 色谱图;(B)馏分 1.13 和1.14 的 HPLC-UV (275nm)色谱图;(C)馏分 1.13 ECG 质谱图;(D)馏分1.13中ECG 35V 时源内 CID 的质谱图。

    各馏分的纯度分析总结在表 1 中。由数据可见，主要儿茶素 EGCG 的纯度为99.8%，两种次要儿茶素 EGC 和 ECG 的纯度均为 100%。

结论

    • 该方法可分离纯化茶叶提取物中的主要儿茶素，纯度为 95%-100%。主要儿茶素 EGCG 的纯度为 99.8%，具有很高的商业价值。

    • AIS 提供的 puriFlash 5.250 Prep LC/Flash 和 HPLC-CMS 的组合是提取纯化茶多酚的简单而高效的解决方案。此解决方案也可以用于其他天然产物的分离纯化，遵循类似的工作流程，如下所示:

    • 收集的馏分可以通过 CMS 测试直接进行鉴定，expression CMS 小型台式质谱仪提供了更快捷更灵活的检测和收集方法。