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应用指南 | 基于 AIS 质谱-制备系统进行黑米中 Cyn-3-Glu 的提取、鉴定、纯化及定量研

Advion Interchim Scientific

2023/02/17 15:18

阅读：110

应用指南 | 基于 AIS 质谱-制备系统进行黑米中 Cyn-3-Glu 的提取、鉴定、纯化及定量研究

大米是大家餐桌上最重要的食物之一，尤其是在亚洲国家。而在各种大米品种中，黑米因其高营养价值和有益健康的特性受到越来越多的关注。黑米是一种富含花青素的水稻，含有矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyn-3-Glu）、矢车菊素-3-芸香糖苷（Cyn-3-Rut）、芍药素-3-葡萄糖苷（Pn-3-Glu）和其他花青素。其中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷是黑米中的主要花青素。

本应用案例采用 Advion Interchim Scientific 的质谱-制备系统，为大家详细展示了从黑米中提取、鉴定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyn-3-Glu）并使用 prepLC/Flash 系统进行纯化的实验方案。

实验仪器配置

Flash 纯化系统: puriFlash® 5.250 高压纯化制备系统，puriFlash XS-Vap® 蒸发器

质谱系统：expression® CMS 小型台式质谱仪

HPLC 液相系统: Advion AVANT

实验流程及方法

Part 1 样品提取

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyn-3-Glu)的提取

黑米购自当地杂货店，用研磨机磨成细粉，采用以下方法提取：

1.将 30g 磨碎的黑米加入 200mL 甲醇（经 1.0N HCl（85:15，v/v）酸化），并超声处理15min。

2.将混合物在 4°C 下以 7500 rpm 离心 5min,将上清液倒入干净的烧瓶中，再次用 200ml 甲醇（经 1.0N HCl（85:15，v/v）酸化）提取，并超声处理 15min。

3.合并两次提取的上清液，并使用 puriFlash XS-Vap 蒸发器将其蒸发至 25ml。

4.取部分浓缩提取物，用水稀释 10 倍，用于 HPLC/UV/MS 分析，其余部分直接进行 PrepLC/Flash 纯化。

‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍P‍‍art 2 LC-UV-MS 方法分析‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍

HPLC/UV/MS 分析方法

黑米提取物的 HPLC/MS 分析

黑米浓缩提取物用蒸馏水稀释 10 倍，用于 HPLC/CMS 分析。

质量范围为 200 至 800 Da，HPLC/MS 色谱图如图 1a 所示。图 1b 显示了 12.10 min 时的质谱图信息，在 ESI 正离子模式下检测到 m/z 449.2 处的单个离子。源内 CID 的谱图如图 1c 所示，显示了 m/z 287.0 处的碎片离子峰。

图1 A.黑米提取物的 HPLC/MS 色谱图；B.12.10min 时质谱图信息；C.12.10min，源内 CID 30V 谱图

质谱图数据库搜索

通过 Advion Data Express 中的 MS 数据库搜索，在 12.10 min 洗脱的化合物确认为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷 (Cyn-3-Glu)。

图2 图 1c 提取物中 MS 谱图的谱库搜索结果

Peak Express 软件有效识别其他花青素

在质谱数据处理软件 Data Express 中的 Peak Express™ 功能可以动态确定所检测到的所有离子的强度变化率和标准偏差，帮助有效识别其他花青素信息。

Peak Express™ 可以检测 ΔIC 色谱图（图 3b）中 14.41 min 处的另一个峰，该峰在其 TIC 色谱图中几乎没有显示（图 3a）。ΔS Delta 谱图和源内 CID 显示在 m/z 463.3 和 301.1 处检测到两个离子。

图3 A. 黑米提取物的 HPLC/MS 色谱图；B. 黑米提取物 ΔIC 图谱；C. 14.41 min 处的 ΔS Delta 谱图，源内 CID 为 30V

MS 数据库搜索确定其为芍药素-3-葡萄糖苷（Pn-3-Glu），搜索结果如图 4 所示。

图4 图 3c 中 ΔS Delta谱图库搜索结果

黑米提取物的 HPLC/UV 分析

黑米提取物也进行了 HPLC/UV 分析。在 278 nm 和 518 nm 处发现了矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyn-3-Glu）的两个特征紫外吸收峰（图 5b）。

图5 A. 黑米提取物的 HPLC/UV 色谱图；B. 12.07min 的紫外吸收曲线

Part 3 分离纯化

矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyn-3-Glu）的 PrepLC 纯化方法

在 AIS puriFlash® 5.250 PrepLC/Flash 系统上进行黑米提取物纯化。方法表中列出了溶剂和分离方法的详细信息，黑米提取物（3ml样品）的 PrepLC/UV 色谱图如图 6 所示。通过 HPLC-UV/MS 对收集的每个馏分进行分析，以鉴定并进行纯度分析。

图 6 puriFlash® 5.250 PrepLC/Flash 系统上的黑米提取物 prepLC 色谱图 (520 nm)

馏分 2、5 和 8 的 HPLC/UV 分析

通过 HPLC/UV/MS 分析所有馏分。HPLC/MS 分析显示馏分 1 为杂质（m/z 611），矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyn-3-Glu）的紫外响应低。馏分 2-8 的纯度大于 97.6%。以馏分 2、5 和 8 的 HPLC/UV 色谱图为例，如图 7 所示，馏分 2 的纯度为 97.6%，馏分 5 和 8 的纯度为 100%。