应用指南 | 基于 AIS 质谱-制备系统进行黑米中 Cyn-3-Glu 的提取、鉴定、纯化及定量研究
大米是大家餐桌上最重要的食物之一,尤其是在亚洲国家。而在各种大米品种中,黑米因其高营养价值和有益健康的特性受到越来越多的关注。黑米是一种富含花青素的水稻,含有矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyn-3-Glu)、矢车菊素-3-芸香糖苷(Cyn-3-Rut)、芍药素-3-葡萄糖苷(Pn-3-Glu)和其他花青素。其中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷是黑米中的主要花青素。
本应用案例采用 Advion Interchim Scientific 的质谱-制备系统,为大家详细展示了从黑米中提取、鉴定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyn-3-Glu)并使用 prepLC/Flash 系统进行纯化的实验方案。
实验仪器配置
Flash 纯化系统: puriFlash® 5.250 高压纯化制备系统,puriFlash XS-Vap® 蒸发器
质谱系统:expression® CMS 小型台式质谱仪
![图片](https://img1.17img.cn/17img/images/202302/uepic/cf3c58fd-5db0-4c64-a834-d36e551f563f.jpg)
实验流程及方法
![图片](https://img1.17img.cn/17img/images/202302/uepic/554e5333-11d5-42c1-9898-0559ddd9e49d.jpg)
Part 1 样品提取
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyn-3-Glu)的提取 黑米购自当地杂货店,用研磨机磨成细粉,采用以下方法提取:1.将 30g 磨碎的黑米加入 200mL 甲醇(经 1.0N HCl(85:15,v/v)酸化),并超声处理15min。2.将混合物在 4°C 下以 7500 rpm 离心 5min,将上清液倒入干净的烧瓶中,再次用 200ml 甲醇(经 1.0N HCl(85:15,v/v)酸化)提取,并超声处理 15min。3.合并两次提取的上清液,并使用 puriFlash XS-Vap 蒸发器将其蒸发至 25ml。4.取部分浓缩提取物,用水稀释 10 倍,用于 HPLC/UV/MS 分析,其余部分直接进行 PrepLC/Flash 纯化。![图片](https://img1.17img.cn/17img/images/202302/uepic/1bfea5d0-48a1-4582-8b8f-107431ce8fe0.jpg)
Part 2 LC-UV-MS 方法分析
黑米浓缩提取物用蒸馏水稀释 10 倍,用于 HPLC/CMS 分析。 质量范围为 200 至 800 Da,HPLC/MS 色谱图如图 1a 所示。图 1b 显示了 12.10 min 时的质谱图信息,在 ESI 正离子模式下检测到 m/z 449.2 处的单个离子。源内 CID 的谱图如图 1c 所示,显示了 m/z 287.0 处的碎片离子峰。![图片](https://img1.17img.cn/17img/images/202302/uepic/fce5da14-7664-4bcf-ac6d-105b5b822843.jpg)
图1 A.黑米提取物的 HPLC/MS 色谱图;B.12.10min 时质谱图信息;C.12.10min,源内 CID 30V 谱图 通过 Advion Data Express 中的 MS 数据库搜索,在 12.10 min 洗脱的化合物确认为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷 (Cyn-3-Glu)。![图片](https://img1.17img.cn/17img/images/202302/uepic/9da1eb12-c0b3-4ca6-9add-cc876788f889.jpg)
图2 图 1c 提取物中 MS 谱图的谱库搜索结果 在质谱数据处理软件 Data Express 中的 Peak Express™ 功能可以动态确定所检测到的所有离子的强度变化率和标准偏差,帮助有效识别其他花青素信息。 Peak Express™ 可以检测 ΔIC 色谱图(图 3b)中 14.41 min 处的另一个峰,该峰在其 TIC 色谱图中几乎没有显示(图 3a)。ΔS Delta 谱图和源内 CID 显示在 m/z 463.3 和 301.1 处检测到两个离子。![image.png image.png](https://img1.17img.cn/17img/images/202302/uepic/34538592-b405-42fd-bcc7-12af5d599eb2.jpg)
图3 A. 黑米提取物的 HPLC/MS 色谱图;B. 黑米提取物 ΔIC 图谱;C. 14.41 min 处的 ΔS Delta 谱图,源内 CID 为 30V
MS 数据库搜索确定其为芍药素-3-葡萄糖苷(Pn-3-Glu),搜索结果如图 4 所示。![图片](https://img1.17img.cn/17img/images/202302/uepic/8e76e561-53ad-424d-91ab-2cede87346f8.jpg)
图4 图 3c 中 ΔS Delta谱图库搜索结果
黑米提取物也进行了 HPLC/UV 分析。在 278 nm 和 518 nm 处发现了矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyn-3-Glu)的两个特征紫外吸收峰(图 5b)。![图片](https://img1.17img.cn/17img/images/202302/uepic/70363959-cc39-452b-a81b-9a0c78eb37dc.jpg)
图5 A. 黑米提取物的 HPLC/UV 色谱图;B. 12.07min 的紫外吸收曲线
Part 3 分离纯化
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyn-3-Glu)的 PrepLC 纯化方法 在 AIS puriFlash® 5.250 PrepLC/Flash 系统上进行黑米提取物纯化。方法表中列出了溶剂和分离方法的详细信息,黑米提取物(3ml样品)的 PrepLC/UV 色谱图如图 6 所示。通过 HPLC-UV/MS 对收集的每个馏分进行分析,以鉴定并进行纯度分析。![图片](https://img1.17img.cn/17img/images/202302/uepic/12a4d363-7d25-4d0d-a335-f0766e02a18f.jpg)
图 6 puriFlash® 5.250 PrepLC/Flash 系统上的黑米提取物 prepLC 色谱图 (520 nm)
通过 HPLC/UV/MS 分析所有馏分。HPLC/MS 分析显示馏分 1 为杂质(m/z 611),矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyn-3-Glu)的紫外响应低。馏分 2-8 的纯度大于 97.6%。以馏分 2、5 和 8 的 HPLC/UV 色谱图为例,如图 7 所示,馏分 2 的纯度为 97.6%,馏分 5 和 8 的纯度为 100%。![图片](https://img1.17img.cn/17img/images/202302/uepic/ae19471c-fae5-469d-9645-f2a1d0b76c03.jpg)
图7 a.馏分2;b.馏分5;c.馏分8的HPLC/UV色谱图
HPLC/UV法测定矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cyn-3-Glu)含量 为了确认干燥样品的最终纯度,使用经过认证的 Cyn-3-Glu 参考标准对干燥的 Cyn-3-Glu 进行定量分析,以确认其纯度。HPLC 校准曲线如图 8 所示。
![图片](https://img1.17img.cn/17img/images/202302/uepic/a219b994-4983-4965-91cb-cc94f56edf9d.jpg)
图 8 Cyn-3-Glu的 HPLC/UV 校准曲线
Part 4 结论
通过建立的 HPLC/UV/MS 和 PrepLC 方法,可以对黑米提取物中的 Cyn-3-Glu 进行分离、纯化和定量。 从 30g 黑米中纯化出 25.5 mg Cyn-3-Glu,纯度为 99.0%。 Interchim PrepLC/Flash 技术与 Advion HPLC-UV/CMS 技术相结合,建立了一种从黑米样品中提取纯化 Cyn-3-Glu 的简单、经济的解决方案。 同时,Advion Interchim Scientific 质谱-制备整体解决方案,为天然产物纯化中目标化合物的鉴定和纯度分析提供了一种高效、便捷的方法。
关于Advion Interchim Scientific
Advion Interchim Scientific 致力于分离鉴定、纯化制备技术的开发应用,expression CMS 质谱系统拥有独特的专利技术,兼顾灵活性、易用性、可靠性,可快速准确提供高质量数据。pufiFlash 快速制备系统实现智能纯化,多种检测方式可供选择,色谱柱齐全,性能优越。
![图片](https://img1.17img.cn/17img/images/202302/uepic/dc9af670-5341-4566-8c21-13c806f09848.jpg)
Advion Interchim Scientific 作为专业的仪器、耗材研发和生产供应商,可为您提供一站式服务,从多样的色谱柱耗材到高性能制备纯化仪器,以及后续的质谱检测系统,全方位助力科研实验,让您省心又省力!
更多资讯请关注 AIS 微信公众号
AIS官网:https://advion-interchim.com/