应用指南—TLC/CMS 薄层色谱/质谱联用实时监测肽合成反应

        基于薄层色谱( TLC )和 expression CMS 质谱的实时反应监测是科研工作者克服合成挑战和优化化学反应的一种简单、快速的方法。Fmoc 保护基可与酸脱去的保护基搭配而用于液相和固相的肽合成，可以很容易地合成具有药学价值的多肽。这种反应的一个实例就是酰基载体蛋白 (ACP) 类似物的合成，它是脂肪酸合成途径的一个组成部分。

反应过程

试剂：

Fmoc-Asn-(Trt)-OH ( FMOC-Nγ-三苯甲基-L-天冬酰胺，1.0 mM, 600 mg)；

O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU, 1.0 mM, 400 mg) ；

二氯甲烷（DCM）；

N,N-二异丙基乙胺 (DIEA, 2.65 mM, 465 µL) ；

甘氨酸叔丁酯盐酸盐 (H-Gly-OtBu, 0.65 mM, 109 mg)；

三(2-氨乙基)胺 (TAEA, 3.5 mL)；

仪器：

expression CMS 小型台式质谱仪（Advion Interchim Scientific）；

TLC 薄层色谱-质谱接口（Advion Interchim Scientific）

图1 expression CMS 和 TLC 薄层色谱-质谱接口

反应：

        将 FMOC-Nγ-三苯甲基-L-天冬酰胺，1.0 mM 和 HBTU，1.0 mM 搅拌溶解于 10mL 二氯甲烷中；加入 DIEA，2.65 mM 活化氨基酸，搅拌5 min；加入H-Gly-OtBu, 0.65 mM，室温反应1h。

        将反应混合物用 10mL DCM 稀释并用10mL水、10vol％碳酸钠和盐水洗涤。

        二氯甲烷在硫酸镁上干燥，过滤，并添加 TAEA，3.5 mL。

        将上述样品搅拌 5 分钟，并用 7mL 盐水、磷酸盐缓冲液（1.76 mol/L，pH值至5.5）和盐水洗涤。此时透明有机层含有第一步的二肽产物。

        继续反应，直到达到最终的氨基酸长度。

图2 Carpino等所述的 Fmoc 保护基策略，合成具有药用价值的肽的实验方案

实验过程

TLC 板的样品采集和方法开发

        在1小时反应的不同时间点取 1µL 反应混合物进行点样。在 DCM/甲醇/乙酸的混合物（9：1：0.1）展开。在 254nm 的紫外光照射下确认斑点位置。

TLC/CMS分析

        薄层色谱斑点用自动薄层色谱提取装置 (plate express TLC) 进行提取。流动相为 80/20 ACN/水+ 0.1vol% 甲酸，200µL/min，通过 ESI 电喷雾电离源将提取的分析物送至质谱仪。

实验结果

薄层色谱 TLC/CMS可实现直接反应监测

        将 1µL 反应混合物置于硅胶薄层色谱板上，展开后显影，监测肽合成的第一步。进行了 TLC/CMS 分析，结果显示，斑点 4 代表了所需的产物（红色箭头）。在 m/z 732.20 处检测到产物的 (M+Na)+ 信号。各个点的强度-时间曲线，与文献建议的反应时间为 60 分钟相比，可以看到在 20 分钟左右反应已经基本完成。

适用于广泛的化合物，包括受保护和未受保护的肽

        图4：将反应溶剂去除后，进行薄层色谱分离，显示 fmoc 保护（左）和未保护（右）的二肽产物。TLC/CMS分析可以通过M /z 732.21 (C)和M /z 510.15 (D)处的(M+Na)+离子确定两种产物。

薄层色谱 TLC/CMS直接鉴定化学反应的反应物和产物

         图5：TLC/CMS 可以识别在硅胶 TLC 板上分离的复杂混合物中的目标产物点。斑点 2 显示反应物的预期 m/z 信号，斑点 6 显示目标产物四氨基酸肽的 m/z 信号。两种分析物都被检测为 (M+Na)+ 离子。

肽合成反应的多个步骤的反应过程控制

        图 6：通过 TLC/FIA/MS 分析 Fmoc 保护肽，确认在反应序列的最初三个步骤中构建了正确的产物。

实验总结

        1、薄层色谱/CMS能够识别化学肽合成反应的反应物、产物和副产物。

        2、Fmoc 保护和未保护的肽，以及最后四个氨基酸肽均可检测到。

        3、TLC/CMS可以监测肽合成的化学反应，与文献建议的反应时间为 60 分钟相比，可以监测到在 20 分钟左右反应已经基本完成。

        4、在合成化学反应监测中，薄层色谱 TLC/CMS 是一种快速、准确的分析物检测的理想组合。