Blue Pippin全自动回收PCR产物提高病毒准种的鉴定准确性

病毒准种（Viral quasispecies）是指遗传物质高度相似但不完全相同的异质性病毒群体。早期，病毒准种研究由单个病毒模板的Sanger测序完成，但通量低（仅限于几十种病毒）、成本高，不适合大量病毒的同时测序。进入二代测序，该研究依然面临读长短（150-600bp），无法对病毒准种的跨基因连锁进行有效分析。而PacBio和纳米孔测序因为固有的错误和PCR过程中引入的错误，尤其是PCR过程的重组嵌合体多被误认是体内病毒重组产生，大大降低了病毒准种的评估准确性。

为了解决这类问题，研究人员在第一轮cDNA PCR扩增的引物加入6-12nt的唯一分子标识符（unique molecular identifiers ，UMIs），标记不同来源的病毒，用以消除后续分析PCR和测序产生的错误。然而单个UMI（sUMI）不能保证在PCR过程中始终识别模板转换（如重组）产物。因此在cDNA另一条链上加入第二个UMI，比较不同UMI组合的频率及家族之间的UMI序列（dUMI），可识别出代表PCR期间“重组”分子的Reads。但是dUMI也存在一些问题，如去除文库中多余引物的纯化步骤造成样本损失，导致dUMI的准确度可能和sUMI并无太大差别。因此，迫切需要找到一种有效的测序方法，提高病毒准种识别和鉴定的准确性。

华盛顿大学医学与公共卫生学院微生物学的一个研究团队于2023年在《 Virus Evolution 》发表一篇“Optimized SMRT-UMI protocol produces highly accurate sequence datasets from diverse populations – application to HIV-1 quasispecies”文章聚焦于解决上述问题。在该项研究中，基于PacBio滚环测序方法，通过比较sUMI和dUMI方法、全自动DNA片段回收和磁珠回收，以及不同PCR循环数等因素对于文库制备的影响，开发了一种适合病毒准种测序分析的建库方法。

实验方法：

• 1.cDNA合成

构建含有UMI-1的引物（图1A），用该引物反转录样本中的RNA生成cDNA（图1B,1 ）。

• 2.巢式PCR第一轮扩增

对于sUMI样本，用上一步cDNA直接第一轮PCR扩增；对于dUMI样本，先用一轮PCR引入另一条UMI-2序列，磁珠纯化后完成第一轮PCR扩增（图1B,2-5）。

• 3.样本回收

利用美国Sage Science公司的Blue Pippin全自动DNA片段回收仪和磁珠法分别回收PCR特定片段长度的产物（图1B,6 ）。

• 4.巢式PCR第二轮扩增

将回收后的PCR产物再次扩增延伸后，磁珠纯化去除多余引物（图1B,7-8 ）。

• 5.制备待测环状DNA分子

将 SMRTbell 条形码接头连接到 PCR 产物的末端，以形成环状分子以供测序（图1B,9 ）。

• 6.测序分析

PacBio SMRT测序并完成生信分析（图1C），识别具有同样UMI的环状共有序列 （CCS），最终得到病毒准种的结果（图1D）。

图1 实验整体流程 其中Blue Pippin用于纯化第一次PCR产物

实验结果

• 不同PCR产物纯化的方法对于实验效果的影响

在巢式PCR第一轮扩增后，分别比较Sage Science公司Blue Pippin和磁珠法纯化扩增产物以及未纯化产物，发现Blue Pippin 纯化更有效地去除较小片段的 PCR 杂带，而且产物得率远高于磁珠法。（图2）

图2 根据纯化方法和PCR循环数对产物进行凝胶电泳和分析。Blue Pippin纯化的条带更粗，且没有杂带，说明回收得率更高，纯化效果更好

不仅如此，在巢式PCR第二轮扩增中，比较不同纯化方法、PCR循环次数对PCR产生重组DNA比例的影响，发现Blue Pippin纯化的样本中，重组DNA杂带的比例明显少于磁珠法纯化样本以及未纯化样本。说明Blue Pippin纯化效果优于磁珠法（图3）。此外，同样利用Blue Pippin纯化样本，如果PCR循环数越少，纯化样本中重组DNA杂带的比例也越低。因此，同样样本体系，通过Blue Pippin可减少PCR循环数并提升文库质量。

图3 每个sUMI家族的重组读长比例，按PCR中的平均模板输入分组，其中每个点代表一个单独的sUMI家族，按纯化方法和总PCR循环数着色。

（Blue Pippin纯化样本的测序实验结果说明，相对于磁珠和未纯化样本，Blue Pippin纯化能够有效减少PCR中重组杂带的产生）

• UMI标记方法的优化改进

通过比较sUMI和dUMI测序结果，作者设定了一个sUMI的检测阈值线——同一个 sUMI 族中，如果任何位置的最小一致性小于70%，则判定该序列存在重组或者其他错误（称为 0.7 判定原则）。利用这一判定原则，作者筛选了sUMI测序结果并与dUMI的测序结果进行比较。结果发现绝大部分判定为正确序列的dUMI都能通过0.7 sUMI判定原则。说明这一标准不但有足够的准确性，而且避免了dUMI中由于需要额外的纯化步骤造成的样本损失等弊端。

原文链接：https://doi.org/10.1101/2023.02.23.529831

总结

使用Blue Pippin纯化PCR产物，使用0.7sUMI判定标准，可以有效提高病毒准种测序结果准确性，并避免dUMI带来的得率减少等其他弊端。是一种可行的检测方法。

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