Arrayjet芯片点样仪助力蜱传脑炎病毒检测

环亚生物

2024/05/23 14:16

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蜱传脑炎，是一种由蜱传脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus，TBEV）引起的，经蜱虫传播的传染病，呈现各种神经系统病症，目前尚无特效疗法。其诊断主要依赖于TBEV抗体检测，如酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent ascept， ELISA）和免疫荧光试验（immunofluorescence assay， IFA）。然而，蜱传脑炎病毒所属的正黄病毒属内有很多病毒都存在高度交叉反应，导致TBEV抗体检测的结果有偏差，例如检测中出现西尼罗河病毒（ West Nile virus ，WNV）的假阳性结果。因此急需找到一种高灵敏性和强特异性检测TBEV的方法。

来自荷兰国家公共卫生与环境研究所传染病控制中心的团队，于2024年2月在《Viruses 》上发表了这篇文章。该研究利用蛋白微阵列芯片技术，改进了检测TBEV的方法。

TBEV病毒所属的正黄病毒属，其序列相对保守，是一个含有约11000个碱基的正链RNA病毒，有3个结构蛋白：C，prM和E蛋白，以及7种非结构蛋白：NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。E蛋白包含EDI、EDII和EDIII三个结构域（图1 ）。作者在之前的研究中，使用重组NS1（rNS1）蛋白检测基于NS1多重蛋白微阵列中的抗正黄病毒IgG。通过多重微阵列方法，使用少量样本体积（例如 10 μL 血清）就能快速、高通量同时检测针对多种病毒蛋白的抗体。本文，作者进一步优化，在NS1抗原旁边添加了EDIII抗原，提高了检测TBEV IgG的灵敏度和特异性。

图1 正黄病毒属基因组与实验中构建的EDIII/rNS1基因载体示意图

实验方法

1.制备蛋白微阵列芯片

将TBEV、WNV、ZIKV（寨卡病毒）、USUV（乌苏图病毒）、JEV（日本脑炎病毒）、EDNV（登革热病毒）的EDIII和NS1蛋白，利用英国Arrayjet公司的Marathon系列生物芯片点样仪（新型号Mercury系列）制备成蛋白微阵列芯片。

2.血清样本与蛋白微阵列芯片杂交孵育

感染过或疑似感染过DENV、ZIKV、WNV、USUV、TBEV的患者血清，阴性血清分别与蛋白微阵列芯片杂交孵育，并用芯片扫描仪获取杂交结果。

3.蚀斑减少中和试验（Plaque Reduction Neutralization Test ，PRNT）

将上述血清与病毒混合后孵育，然后加入预先形成的A549单层细胞中，观察并计数斑块形成情况。同时与蛋白微阵列芯片杂交结果比较。

实验结果

NS1蛋白微阵列芯片结果呈现属内高度交叉反应

在NS1的蛋白微阵列芯片杂交结果中，所有的阴性血清都无免疫特异反应。来自感染过或疑似感染过上述病毒的患者血清杂交实验中，大部分血清都和相关抗原出现了免疫阳性结果，而且这些患者血清同时与属内其他病毒出现了阳性反应，这与此前报道的正黄病毒属内有很多病毒都存在高度交叉相一致。

免疫学检测金标准--PRNT的实验结果显示，NS1蛋白微阵列结果中出现的阳性结果在PRNT中都为阳性。在20例TBEV的患者血清实验中，除了蛋白微阵列芯片已经确认的7例之外，还有8份血清也呈现阳性。说明单独检测NS1抗原存在假阴性结果，因此基于NS1抗原的蛋白微阵列流程需要进一步优化。

TBEV EDIII的蛋白微阵列实验结果

为了提高蛋白微阵列检测的灵敏性和特异性，使用EDIII阳性血清（来自接种TBEV疫苗志愿者）和上述血清再次与EDIII蛋白微阵列芯片杂交。结果显示，之前的20份TBEV患者血清 EDIII杂交结果与PRNT结果完全一致——15份血清为阳性，5份为阴性。而这些血清样本对WNV、DENV、ZIKV、USUV 和 JEV 的IgG反应水平则比较低。这说明EDIII的确存在属内交叉反应，但TBEV的反应水平则远高于其他病毒。