全贴式自动聚焦SMALDI质谱成像对患者来源类器官的空间脂质组学表征

2024年7月，国家卫生健康委科学技术研究所高华方研究员、北京航空航天大学生物医学工程学院陈晓芳副教授及北京大学第三医院赵红梅教授共同通讯（兰春燕、彭颖为共同第一作者）在 Analytica Chimica acta 在线发表题为“Spatially lipidomic characterization of patient-derived organoids by whole-mount autofocusing SMALDI mass spectrometry imaging”的研究论文，本研究引入了一种全贴式（whole-mount, WM）类器官前处理方案，可不依赖于切片、原位可视化类器官表面的脂质分子。为了评估该方法的有效性，研究分析了9个乳腺癌类器官（breast cancer organoids, BCOs）和6个正常乳腺类器官（normal breast organoids, NBOs）的脂质分子分布，最终发现来自同一类器官系的不同类器官间具有脂质分子的一致性，而肿瘤类器官和正常类器官间具有显著的脂质分子差异。

患者来源的类器官（patient-derived organoids, PDOs），作为临床前模型在个性化医疗中展现出巨大的潜力，能够准确模拟来源样本的异质性，与原始临床标本表现出高度一致的基因型和组织病理学特性。然而，在进行类器官构建前尚无快速、高效的方法确保肿瘤组织样本的质量，从而无法保证获得的肿瘤类器官中无正常类器官的污染；另一方面，虽然有研究提出在类器官培养过程中优化培养基的配方尽可能避免正常类器官的过度生长，但尚无高效便捷的技术平台直接用于肿瘤类器官和正常类器官的鉴别。

截止目前，类器官的基因组学和组织病理学表征技术已经相对成熟，但由于大多数癌前病变的基因突变特征与癌症样本相对一致，因此无法仅通过基因组学特征进行肿瘤和正常类器官的鉴别。脂质在解析细胞结构和功能方面扮演重要的角色，分析脂质组学特征能够对样本状态有更系统全面的理解，并且对细胞过程、细胞膜动态变化和能量代谢提供一定的见解。本研究创造性提出了全贴式类器官成像方法，即类器官不用切片，直接完整的类器官粘附到载玻片上，然后用 AP SMALDI 5AF & Orbitrap 质谱成像系统直接三维成像，该技术平台有望实现对不同状态类器官的区分。

图1. 基于WM AF SMALDI MSI表征类器官表面脂质组学特征的流程图。

本研究中全贴式类器官样本制备方法结合自动聚焦质谱成像技术免标记直接绘制类器官表面的脂质分子。为了实现上述目的，本研究提出将类器官直接转移至聚-L-赖氨酸涂覆的腔室载玻片表面，促进对多种不同处理条件下类器官的高通量分析。为了保证类器官的形态不被破坏，本研究提出将类器官采用甲醛固定后，用于质谱成像检测，一方面提高了脂质分子检测的数量和灵敏度，另一方面维持了类器官的形态。

通过光学形态图发现，类器官大小不一，且从形态学特征上无法区分肿瘤类器官和正常类器官（图2A）；通过扫描电镜图发现，类器官呈现表面凹凸不平的三维立体结构（图2B）；本研究通过免疫组化染色 HER2,ER,PR 分析发现，构建的乳腺癌类器官和正常乳腺类器官能够保持与来源组织一致的组织病理学特征（图2C）。通过对 Ki67 染色发现，构建的肿瘤类器官的增殖能力显著高于正常乳腺类器官，并且这一特性与来源组织保持一致。这从一定程度上证明，乳腺癌和乳腺正常类器官构建成功。

图2. 是患者来源的类器官形态图，其中图2A明场显微镜观察的类器官形态图，2B是PDOs 的扫描电镜图像，2C是类器官和原始组织的组织学和免疫组化比较图像，上面两行是正常乳腺组织和衍生类器官系的组织学和免疫组化图像，下面两行是乳腺癌组织和衍生类器官系的组织学和免疫组化图像。

之前有研究报道通过免疫荧光染色基于类器官细胞成分的差异进行肿瘤和正常类器官的鉴别，为了确定乳腺癌和癌旁正常类器官表面细胞成分的差异，该研究采用了管腔上皮细胞标记物（CK19）和肌上皮细胞标记物（CK14）进行免疫荧光染色，染色结果显示正常乳腺类器官由 CK14 和 CK19 双阳性的管腔上皮和肌上皮细胞组成，而乳腺癌类器官仅由 CK19 阳性的管腔上皮细胞组成，鉴于细胞极性的差异，研究者认为类器官表面的分子也随细胞成分的差异而有所变化，因此研究者提出，通过建立对类器官表面分子原位检测的方法有望用于对肿瘤和正常类器官的鉴别。

图3. 患者来源正常乳腺组织（A）及类器官（B）和患者来源乳腺癌组织（C）及类器官（D）免疫荧光染色。绿色：CK14；红色：CK19；蓝色：DAPI。

固定过程对于保持类器官精细的三维结构和维持质谱分析所需的脂质信号至关重要。4%多聚甲醛（PFA）是常用的速效固定剂。本研究通过对比发现，固定时间为30分钟时，检测的脂质分子数目最多（图4），因此研究者最后采用固定时间为30分钟进行后续的研究。

图4. 固定时间对细胞球（图A和B）和类器官（图C和D）表面脂质分子检测测影响。

图5A显示，BCOs 和 NBOs 之间的脂质特征差异很大，而在同一患者或类器官系中观察到的差异较小。具体而言，在热图中，从同一患者活检组织培养的类器官聚类在一起，表现出相似程度的脂质组学特征。例如，在 BCOs 组中，＃TO1、＃TO2 和＃TO3 表现出高度相似的脂质特征。如图5B所示，作者使用 t-SNE 聚类对源自15个类器官的23,122个像素的分子特征进行了可视化。结果显示，基于604个脂质特征的相似性，来自同一患者的类器官被更紧密地聚集在一起。在 t-SNE 图谱中，四名患者被明显区分开来。这些结果共同表明，从同一类器官系培养出的 PDOs 表现出相对相似的脂质特征。总结而言，我们发现，来自同一类器官系的类器官表现出更相似的脂质特征。这一发现为类器官研究中的质量控制奠定了基础，并为基于类器官模型的脂质研究提供了宝贵的视角。

图5. NBOs 和 BCOs 的脂质差异，5A根据脂质特征计算的15个 PDOs 的聚类热图；5B是15个 PDO 的 t-SNE 可视化图，每个点表示一个像素点，像素点以 PDOs 编号着色；图5C的 OPLS-DA 图和图5D火山图显示 BCOs 和 NBOs 中脂质的丰度分布和显著差异。

其次，作者评估了 AF SMALDI MSI 在区分不同状态类器官方面的潜力。正如预期的那样，不同状态的 PDOs（如 BCOs 和 NBOs）之间的独特脂质特征表现出更大的差异。图5C显示了所有检测到的脂质在 500-1000 m/z 范围内的正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）得分图，显示出 BCOs 和 NBOs 之间的明显分离。在分析的脂质中，288种脂质（136种脂质在 BCOs 中含量较高，152种脂质含量较低）在 BCOs 和 NBOs 之间的丰度存在显著差异（图5D）。为了直观地表示 BCOs 和 NBOs 之间脂质的空间丰度，图6展示了三个 BCOs 和三个 NBOs 中具有代表性的八种脂质的质谱图。

图6. 质谱成像可视化 NBOs 和 BCOs 脂质差异，图7A和B显示了4种具有代表性的在 NBOs 及 BCOs 中上调的脂质。

文献地址：

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0003267024007906?via%3Dihub