细胞计数纯干货丨AO/PI vs AO/DAPI 哪家强？

AO/PI（吖啶橙/碘化丙啶）和AO/DAPI（吖啶橙/4',6-二脒基-2-苯基吲哚）是细胞计数中最常用的两种荧光染色方法。它们都是细胞核染料，基于细胞膜的通透性区分活、死细胞。AO染所有的细胞核，发出绿色荧光；PI和DAPI只会染死细胞的核，分别发出红色和蓝色荧光。我们一般会认为这两种方法测得的细胞活率是一致的。然而，在细胞治疗产品的工艺开发中，我们经常发现两种方法测得的活率有差异。通常，AO/DAPI比AO/PI测得的活率更高，有时可达到30%。为研究这一差异产生的原因，瑞孚迪（Revvity）的细胞计数研发团队对两种方法在不同条件下的细胞染色和活率检测进行了深入研究。

在加热致死模型中，新鲜的Jurkat细胞被放置在离心管中进行沸水加热。15 ml的离心管加热15分钟；50 ml的离心管加热30分钟；在低温致死模型中，新鲜的Jurkat细胞被放置在4°C低温长达两周。两种方法都可获得完全死亡的细胞样本，低温致死模型被认为更接近细胞的自然死亡。

该研究使用的细胞计数工具为Cellaca MX高通量细胞计数仪自动计数。Cellaca MX拥有明场和多色荧光通道，可兼容AO/PI和AO/DAPI两种荧光染色方法。上图表格列出了各染料所对应的激发光和发射光波长，以及对应的活率计算公式。

为验证制备的死细胞样本是否完全失去活性，研究人员将加热致死和低温致死的细胞样本用新鲜培养基进行换液，再继续培养5天，每天用AO/PI和AO/DAPI对细胞数量和活率进行监测。研究人员也用新鲜Jurkat细胞和两种方法制备的死细胞样本进行混合，得到了理论活率10%的样本作为对照组。

如上图所示，加热致死和低温致死的细胞样本在5天中没有增殖，说明细胞均已完全失去活性。对照组的细胞均有明显增殖。有趣的是，低温致死的样本细胞数量逐日减少，有可能是因为长时间低温处理导致了DNA降解，使染料与细胞核的结合下降，荧光强度减弱，从而细胞不被识别。

在全死细胞样本检测的第0天，AO/PI测得的加热致死和低温致死样本的活率均为0%，与预期相同。而AO/DAPI测得的活率分别为9%和17%，明显高于预期。在5天的连续监测中，AO/PI测得的两组死细胞样本的活率始终为0%，而AO/DAPI测得的活率不稳定，在0-15%之间波动。对照组样本的活率在5天中持续上升。

在细胞计数操作流程中，AO/PI和AO/DAPI都是即染即测。不充分的染色时间有可能会导致不准确的结果。为研究染色时间对活率结果的影响，研究人员用加热致死和低温致死两种条件制备了死细胞样本，然后用AO/PI和AO/DAPI在染色后2分钟、15分钟和30分钟进行了检测。

如上图所示，对于加热致死的细胞样本，两种方法测得的细胞总数、活、死细胞数量以及细胞活率在各时间点都保持稳定；AO/DAPI测得的活率比AO/PI测得的活率高~5%。而对于低温致死的细胞样本，随着染色时间的延长，AO/DAPI测得的死细胞数量有明显上升，活率从26%降低至11%；AO/PI测得的死细胞数和活率保持稳定，在三个时间点都几乎为0%。该结果表明，对于低温致死的细胞样本，AO/DAPI需要更长的染色时间才能得到稳定的活率结果（>30分钟）；AO/PI的染色则不受染色时间的影响，既染即测也可以获得稳定准确的活率结果。另外，AO/DAPI即使染色30分钟后，测得的低温致死样本的活率仍然比AO/PI测得的高~10%。

为了研究两种染色方法活率结果的差异是否和细胞样本的健康状态有关，实验人员将新鲜的和低温致死的Jurkat细胞按比例进行了混合，制备出理论活率为100%，75%，50%，25%和0%的细胞样本，并同时用AO/PI和AO/DAPI进行检测。

上图(a)为各活率梯度样本染色后立即检测的活率结果。当样本理论活率为100%和75%时，AO/PI和AO/DAPI测得的活率非常接近；然而，当样本理论活率下降到50%及以下时，两种方法测得的活率开始出现明显差异。在理论活率为0%时，AO/PI测得的活率也为0%，但AO/DAPI测得的活率为13%。图(b)为染色后10分钟内用两种方法对所有样本多次检测的结果。和之前的结果相似，染色时间越长，AO/DAPI测得的活率越低，而AO/PI则不受时间因素影响。此实验结果表明，AO/PI在不同的样本健康状态和染色时间条件下都可以获得稳定，而且和理论值一致的活率结果，比AO/DAPI更为可靠。