如何进行辐射性杂交的制图

2015-12-28 07:33

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资料摘要：

1．原理利用高剂量的X射线将候选染色体打断成若干片段，含有这种片段的细胞可与仓鼠细胞形成杂交克隆。在这种杂交中，人类染色体片段被插入到仓鼠染色体的中间部分，因此大部分克隆片段在进行有丝分裂时处于稳定的状态。利用类似于遗传重组原理和最大似然性的统计学方法来计算存在于DNA片段上的多态性或非多态性标记之间的断点频率，以此估计标记之间的距离，并建立人类基因组拷贝库---体细胞杂交系统。可根据不同要求构建出断裂程度不同的多套拷贝，从而得到不同分辨率的放射杂交图。总之，辐射性杂交是建立在受到X射线照射的供体细胞与非放射线处理的受体细胞融合基础上的一种体细胞遗传学方法，是利用两个标记之间被X射线打断的概率来计算标记之间距离，通过类似于减数分裂连锁制图的方法来确定标记之间的顺序。 2．试验流程 G3嵌板的产生→确定STSs→PCR体系及反应条件→构建RH图谱. 3．特点优点荧光原位杂交(FISH)法和辐射杂种细胞系(RH)技术是国际上最常用的基因定位的两种方法，各有优缺点。FISH可以定位基因组中多个同源位点，结果直观、可靠，而RH法则很困难。但是FISH法检测步骤繁杂，尤其受探针大小的影响较大，2kb以下的cDNA序列很难定位，而且结果需要有经验的细胞遗传学家进行分析。RH法简单易行，定位精度高，适合小于 lkb--2kb以下的序列，根据统计学方法可直接定位。其结果也便于不同实验室间比较。和其他作图法相比，RH作图法是依赖于辐射引起的断点而不是靠减数分裂重组得到的断点，是一种完全独立的方法，所以是一个互补的作图方法，可利用所有不同的STSs，具有巨大的DNA补充潜力，从而有利于整合不同的遗传和转录图以及所有基因组位标(无名序列、中心粒和端粒)。缺点但是RH法也受到某些自身条件的限制，RH嵌板中每个杂交克隆均包括仓鼠和人的基因组DNA，可以看作是在仓鼠基因组DNA背景下相区别。如有些基因无法定位的原因即在于它的序列包括阅读框架以及3，UTR区域与仓鼠的相似性高达90%以上。此外，做ESTs或全长 cDNA定位的引物为cDNA序列，而RH法是在基因组DNA上扩增出相应的片断，由于内含子序列的存在，扩增结果与引物设计的部位直接有关，一般应选用3，UTR部位的序列。还应指出，用RH法能否成功定位，依赖于该基因所在染色体区域上合适位标的存在。如果现有的RH图中此区域分布的合适位标过少，可改用位标位点多的嵌板。因此随着今后RH图精度的提高，越来越多的STSs被放置于染色体上，有望弥补这个缺陷。 4．应用辐射性杂交技术是继荧光原位杂交后新近建立的染色体定位方法，RH作图法提供了一种联系物理图和遗传图的方法，已成为当今构建人类基因组大尺度、高密度、连续的染色体图的常用方法之一。其用途主要有：EST定位、基因克隆、基因组作图、测定距离、寻找新基因等。

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